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葛根总黄酮和青蒿琥酯体外抗急性早幼粒细胞白血病细胞的实验研究

发布时间:2020-08-13 06:23
【摘要】:第一部分葛根总黄酮体外调控NB4细胞凋亡及自噬的实验研究研究目的葛根总黄酮(PRF)是中药葛根的总黄酮提取物,课题组前期研究证实PRF对多种白血病细胞株有增殖抑制和诱导凋亡的作用,可能与JNK活化有关,其中以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞最为明显。因此,本研究进一步以NB4细胞为研究对象,探讨较低浓度PRF诱导NB4细胞凋亡抑或自噬的作用及可能的分子机制。实验方法1.0、10、30、50μg/mlPRF体外作用于NB4细胞24,48,72h,MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期,凋亡率及线粒体膜电位等。2.0、10、30、50μg/ml lRF体外作用于NB4细胞48h,western blot检测细胞凋亡相关的蛋白caspase-9,cleaved-PARP,cleaved-caspase-3,MAPKs家族蛋白中p38,ERK和JNK,以及JNK通路磷酸化蛋白p-JNK,p-c-Jun,p-MKK4,自噬相关蛋白p62,Beclinl和LC3等蛋白表达。3.30μg/ml PRF分别联合自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂雷帕霉素,western blot检测凋亡蛋白PARP和cleaved caspase-3的表达。4.0、1、5、10μg/ml PRF体外作用于NB4细胞48h,FCM检测细胞表面标记CD33,CD15和CD11b的表达。结果1.MTT结果显示10、30、50μg/ml PRF显著抑制NB4细胞增殖,呈明显的时间、浓度依赖性,48h增殖抑制率分别是42.12%±4.20%,66.79%±6.23%,82.09%±2.3 6%。2.FCM结果显示0、10、30、5μg/ml PRF处理48h引起NB4细胞凋亡率分别为6.81%,9.27%,14.74%和31.91%,呈浓度依赖性增加;线粒体膜电位的检测,显示各组JC-1聚合体分别为94.25%,88.41%,78.77%和61.10%,而各组JC-1单体分别为5.75%,11.59%,21.08%和38.87%。3.FCM检测细胞周期显示G1期比例增加,10、30、50μg/ml PRF分别是46.47%,53.05%和60.81%,而G2期比例降低,分别是21.90%,15.55%和9.71%。4.Western blot法对凋亡标志蛋白的检测发现PRF上调caspase-9,cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的表达,对Bc12家族蛋白的检测显示抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达上调;检测MAPKs家族蛋白发现PRF对p38和ERK表达没有明显影响,但下调JNK蛋白表达,继而检测JNK通路的磷酸化表达显示PRF引起p-JNK,p-c-Jun和p-MKK4表达上调。5.Western blot法检测自噬相关蛋白的表达发现10、30、50μg/ml PRF引起NB4细胞的Beclinl和LC3 II表达上调,而p62表达下调。进一步采用30μg/ml PRF分别联合自噬抑制剂3-MA或自噬激动剂雷帕霉素,发现联合3-MA组cleaved-PARP和cleaved caspase-3较单药组表达增加,而联合雷帕霉素组表达降低。6.采用FCM对细胞表面抗原的分析显示,更低浓度(1、5、10μg/ml)PRF能增加NB4细胞表面CD11b和CD15的表达,降低CD33表达阳性率。结论10-50μg/ml PRF能有效抑制NB4细胞增殖,阻滞细胞周期于G1期,诱导细胞凋亡;PRF诱导NB4细胞凋亡过程伴有线粒体膜电位降低,p-JNK、p-MKK4和p-c-Jun蛋白上调。同时PRF诱导NB4细胞凋亡过程中伴有自噬水平升高,检测到LC3 II表达上调且p62表达下调,分别联合3-MA或雷帕霉素结果提示PRF作用NB4细胞引起自噬水平升高起抗凋亡作用;1、5、10μg/mlPRF还能一定程度诱导NB4细胞向成熟粒细胞分化。第二部分青蒿琥酯体外抗NB4,HL-60及NB4-R1细胞的实验研究研究目的青蒿琥酯(ART)是青蒿素的半合成衍生物,对多种血液肿瘤表现出抗肿瘤效应。本研究拟探讨ART对NB4,HL-60和NB4-R1细胞的作用和可能机制。实验方法1.0、2、10、20μg/mlART体外处理NB4,HL-60和NB4-R1细胞12、24、48h,MTT检测细胞增殖抑制率。2.0、2、10、20μg/ml ART体外处理NB4,HL-60和NB4-R1 细胞24h,TUNEL染色观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡率。3.0、2、10、20μg/ml ART体外处理NB4,HL-60和NB4-R1 细胞24h,western blot检测凋亡相关蛋白caspase-9,caspase-3,PARP,自噬相关蛋白p62,Beclin1,MAPKs 家族蛋白 p-p38,p-ERK,p-JNK,JNK,p-ATF-2,p-MKK4,PI3K/AKT/mTOR通路蛋白p-AKT,p-mTOR,FOX03a,内质网应激蛋白IRE1α的表达。结果1.MTT结果显示2、10、20μg/ml ART作用NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞系12、24、48h后,细胞增殖显著受抑,且与时间、浓度呈正比。2.采用TUNEL染色观察1Oμg/ml ART处理48h后,与空白对照组相比,NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞均表现出明显的TUNEL阳性率增高。3.FCM检测细胞凋亡率显示2、10、20μg/mlART能明显增加NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞的凋亡率,NB4各组凋亡率分别为5.09%、13.81%、33.71%,NB4-R1分别为9.06%、14.75%、29.59%,HL-60分别为12.18%、23.91%、53.28%呈明显的浓度依赖性。4.Westemblot结果显示2、10、20μg/mlART对NB4,HL-60和NB4-R1三种细胞都有上调cleaved caspase-3,cleaved PRAP和caspase-9表达的作用,并下调pro-caspase-3表达。5.对MAPKs家族蛋白的检测发现2、10、20μg/mlART在这三个细胞系中都能引起p-JNK,p-ATF-2和p-MKK4表达增加,JNK表达降低。不同的是ART在NB4细胞中对p-p38和p-ERK表达没有明显影响,但在HL-60和NB4-R1细胞中上调p-p38和p-ERK的表达。6.Western blot检测PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达显示2、1 0、20μg/ml ART抑制了三种细胞的p-AKT和p-mTOR的表达,并引起FOX03a表达增加。7.Western blot检测p62和LC3 Ⅱ表达和内质网应激蛋白显示2、10、20μμg/ml ART在NB4和HL-60细胞中引起IRE1α以及p62和LC3Ⅱ同时表达上调,但在NB4-R1细胞中未见此变化。结论2、10、20μg/mlART能有效抑制NB4,HL-60和NB4-R1细胞增殖,诱导凋亡发生,其过程伴有p-JNK、p-ATF-2和p-MKK4表达上调,抑制p-AKT、p-mTOR表达,上调FOXO3a表达有关。ART在NB4和HL-60细胞还能引起LC3Ⅱ和p62以及内质网应激蛋白表达上调,而在NB4-R1细胞并未发现类似改变,是否与维甲酸耐药相关有待进一步研究证实。
【学位授予单位】:南京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R285
【图文】:

浓度依赖性,空白,抑制作用,对照组


胞增殖的影响。结果显示,与DMSO对照组相比,10,邋30,邋50^g/mlPRF处理48逡逑小时后,显著抑制NB4细胞的增殖,分别为42.12%±4.20%,66.79%±6.23%和逡逑82.09%±2.36%,呈明显的浓度依赖性。结果见图2-1。逡逑表2-1:不同浓度PRF作用24,48,72h后对NB4细胞的增殖抑制作用逡逑逦(x±SD,邋n=5,邋*P<邋0.01,邋**P<邋0.05)逦逡逑增殖抑逦逦逡逑^率(%)逡逑日寸丨DMSO邋PRF邋10|ug/ml邋PRF邋30^g/ml邋PRF邋50|ag/ml逡逑24h逦6.20±3_52逦21.37±8.64*逦31.54±4.40邋*逦40.80±2.22*逡逑48h逦13.97±2.70逦42.12±4.20*逦66.79±6.23**邋82.09±2.36**逡逑逦72h逦17.93±3.50逦67.70±4.19**逦81.83邋土邋4.78**逦85.06±5.29**逡逑1001逦100l逡逑?邋DMSO逦m邋DMSO逡逑^邋80-逦7邋—-m-邋10ug/mi邋■邋p-邋so-逦_逦—.邋■邋I0ug/ml逡逑V逦J逦★邋30ug/ml逦V逦T邋I逦t邋II逦m邋30ug/ml逡逑2邋60-逦/50ug/m!逦2邋60-逦■■逦■■■逦■邋50ug/ml逡逑丨邋kill邋J逡逑24h逦庿逦72h逦^逦^逡逑Time逦Time逡逑图2-1逦10,邋30,邋50fig/mlPRF干预24,48,邋72h对NB4细胞的增殖抑制逡逑作用逡逑注:与空白组对比

细胞周期,博士学位论文


逦南京中医药大学博士学位论文逦逡逑表2-2不同浓度PRF作用48h后对NB4细胞周期的作用逡逑逦(x±SD,邋n=5,*P<邋0.01/*P<邋0.05)逦逡逑Group逦Gl(%)逦S(%)逦G2(%)逦逡逑DMSO逦43.39±2.06逦27.35±3.35逦29.25邋士邋1.32逡逑PRF邋lO^ig/ml逦46.47±2.53逦31.63土3.76逦21.90土邋1.98逡逑PRF邋30终g/ml逦53.05土邋1.07逦31.4土2.45逦15.55邋±4.76*逡逑PRF邋50^ig/ml逦60.81邋土3.10*逦29.48士邋1.83逦9.71邋土4.13*逡逑DMSO逦4邋PK卜邋I0jig/ml逡逑

流式细胞术,线粒体膜电位,凋亡信号


细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,主要受两种途径启动,分别为线粒体途径逡逑和死亡受体途径。线粒体途径的一个基本特征就是线粒体膜电位紊乱,才会发生逡逑出膜改变,促凋亡蛋白从线粒体释放,激活进一步的凋亡信号。因此我们进一步逡逑检测了邋PRF干预后NB4细胞的线粒体膜电位,结果如图2-4所示,与空白对照逡逑组相比,经PRF处理后的NB4细胞发生了线粒体膜电位降低,而且这种作用呈逡逑浓度依赖性。说明PRF可能是通过线粒体途径激活凋亡信号从而触发凋亡发生。逡逑表2-4不同浓度PRF作用NB4细胞48h对线粒体膜电位的影响逡逑Control邋PRF邋10|ig/ml邋PRF邋30|ig/ml邋PRF邋50|ig/ml逡逑UR(%)逦94.25逦88.41逦78.77逦61.10逡逑LR(%)逦575逦j_L59逦21.08逦38.87逡逑

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