【摘要】：目的:本课题通过观察体内实验中空腹血糖(FPG)、胆固醇(TC)、脂肪酸(TG)、游离脂肪酸(FFA)、心肌FABP3蛋白表达量、心肌ATP含量、左心室射血分数(EF%)、心肌形态观察及FABP3蛋白表达量、ATP含量与EF%相关性,进一步探讨益糖康对2型糖尿病大鼠心肌FABP3含量及基因表达方面的影响,并试图揭示其相关性。再通过检测体外实验中H9C2心肌细胞中ATP含量、呼吸链复合物(Ⅰ、Ⅱ)、心肌收缩相关蛋白表达量、脂肪酸代谢相关蛋白表达量,以观察益糖康是否通过调控FABP3表达介导线粒体途径影响心肌收缩相关蛋白从而改善心肌收缩能力,由此完成其机制研究。材料与方法:论文一:SPF级健康雄性Westar大鼠,体重200±20g,2月龄,50只。使用随机数字表法分为5组,分别为正常对照组(10只),模型对照组(10只),高剂量组(10只),中剂量组(10只),低剂量组(10只)。对模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组进行高脂喂养4周后予链脲佐菌素(STZ)45mg/kg腹腔注射造模复制。随机抽取4个造模组大鼠各一只检测血糖超过16.7mmol/L则为造模成功。模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组造模成功后,给予正常对照组和模型对照组大鼠生理盐水灌胃,高、中、低组给予不同剂量的中药益糖康水煎液灌胃(中药制剂水煎液浓度为100%,装瓶备用,于4℃冷藏保存)。以益糖康临床使用剂量为中剂量,2倍为高剂量,1/2为低剂量。上述方法,每天一次,为期4周。给药剂量根据人与生物生药换算公式计算。使用益糖康作为干预因素进行实验干预后2周、4周分别进行空腹血糖检测。治疗结束后,称取体重、取材血清、心肌组织,检测大鼠的空腹血糖(FPG)、胆固醇(TC)、脂肪酸(TG)含量、血清心肌酶谱与游离脂肪酸(FFA)、超声心肌收缩及舒张功能、心肌形态、心肌FABP3的表达、心肌中ATP含量,并采用偏相关分析方法分析FABP3蛋白表达、ATP含量与EF%的相关性。其中空腹血糖(FPG)、胆固醇(TC)、脂肪酸(TG)含量采用全自动生化分析仪检测,游离脂肪酸(FFA)使用Elisa试剂盒检测,心肌FABP3蛋白的表达采用Western-blot方法检测,心肌中ATP含量采用比色法检测,左心室收缩功能使用小动物超声检测,心肌形态使用HE染色法光镜下观察,FABP3蛋白表达、ATP含量与EF%的相关性使用SPSS软件偏相关分析法分析。论文二:本实验采用SPF级Wistar雄性大鼠60只,体重(200±20)g,2月龄,60只以及H9c2细胞作为实验研究对象。采用随机数字表法将60只符合试验标准的大鼠随机分为2组,空白对照组30只,益糖康组30只,各组雌雄各半。按每kg体重大鼠的给药量为人的6.3倍计算,并且每次大鼠给药量为2倍体积正常人入药量,且日2次,空白对照组用蒸馏水灌服,于第4d晨起给大鼠灌胃2h后,予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,采用腹主动脉取血,室内静置2 h后,离心(2500 r/min,4℃,20 min),然后收集血清,56℃水浴灭活30 min,经分装后,-81℃保存。H9C2细胞采用DMEM培养基,含有10 mM葡萄糖,10%FBS,1%青链霉素,于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。含有可变长度的FABP3启动子质粒进行转染后再予以含益糖康血清干预。通过比色法检测ATP含量、呼吸链复合物(Ⅰ、Ⅱ),Western-blot检测心肌细胞心肌收缩相关蛋白(SERCA、RYR2、PLB),Western-blot检测脂肪酸氧化相关蛋白(CPT-1、CPT-2)。结果:论文一:1.高脂饮食喂养结合链脲佐菌素腹腔注射方法制备2型糖尿病大鼠模型后,测定各造模组大鼠的生理指标。空腹血糖:各造模组大鼠共有75%空腹血糖16.8mmol/L(可以保证每组至少10大鼠继续进行实验),与正常对照组比较,各组大鼠空腹血糖均显著升高(P0.01);模型对照组,高、中、低组之间没有显著差异(P0.05)。体重情况:造模后,与正常对照组比较,各造模组大鼠体重均显著升高(P0.01);模型对照组,高、中、低组之间没有显著差异(P0.05)。一般情况:各造模组大鼠均出现多饮、多食、多尿症状。2.使用益糖康为干预因素,进行实验干预,在干预2周、4周时检测各组大鼠体重和空腹血糖,发现与正常对照组比较,各组大鼠体重均显著低于正常对照组(P0.05或P0.01);与模型对照组比较,高、中剂量组显著升高(P0.05),三个剂量组之间没有显著差异(P0.05)。干预4周后,与正常对照组比较,各组大鼠体重均显著低于正常对照组(P0.01);与模型对照组比较,三个剂量组均显著升高(P0.01),三个剂量组之间没有显著差异(P0.05)。而空腹血糖水平则表现为,与正常对照组比较,各组大鼠空腹血糖均显著升高(P0.05或P0.01);与模型对照组比较,高剂量组空腹血糖显著降低(P0.05),中、低剂量组没有显著差异(P0.05);三个剂量组之间没有显著差异(P0.05)。干预4周后,与正常对照组比较,各组大鼠空腹血糖均显著高升高(P0.05或P0.01);与模型对照组比较,高、中剂量组空腹血糖显著降低(P0.01),低剂量组没有显著差异(P0.05);低剂量组显著高于高、中剂量组(P0.01)。3.实验结束后检测大鼠血液中TC、TG、FFA情况显示,与正常对照组比较,各组大鼠TC和TG均显著升高(P0.01);与模型组比较,三个剂量组TC和TG均显著降低(P0.01);三个剂量组之间比较,高剂量组降低最显著(P0.05或P0.01)。4.实验结束后心功能检测显示,造模组大鼠射血分数显著下降。与正常对照组相比,模型对照组大鼠心肌ATP含量下降(p0.01);低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠心肌ATP含量较模型对照组显著升高(p0.01)。5.试验结束后检测各组大鼠心肌FABP3蛋白含量显示,模型对照组大鼠心肌FABP3的蛋白表达量及m RNA水平均显著上升(P0.01)。低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠心肌FABP3的蛋白表达量及mRNA水平较模型对照组下降且与益糖康剂量呈负相关,提示糖尿病心肌组织中,FABP3的表达增加,经益糖康治疗后FABP3表达下降,且随着剂量加大对FABP3表达抑制越发明显。6.控制FABP3蛋白表达时,ATP含量与EF%偏相关系数=0.791,P0.01,则可以认为ATP含量与EF%之间存在线性关系,属于正相关。控制ATP含量时,FABP3蛋白表达与EF%偏相关系数=-0.693,P0.01,则可以认为FABP3蛋白表达与EF%之间存在线性关系,属负相关。论文二:1.对比高、中、低剂量的益糖康含药血清制备效果显示,应使用高剂量益糖康制备含药血清进行后续实验。2.含有可变长度的FABP3启动子质粒进行转染后再予以含益糖康血清干预后,比色法检测H9c2细胞ATP结果显示,与正常对照组相比,FABP3过表达组心肌细胞中的ATP含量明显减少(P0.01),含药血清组心肌细胞中的ATP含量有所减少(P0.05);与FABP3过表达组比较,含药血清组心肌细胞中的ATP含量则有明显提高(P0.01)。3.含可变长度的FABP3启动子质粒进行转染后再予以含益糖康血清干预后,比色法检测H9c2细胞呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ结果显示,与正常对照组相比,FABP3过表达组心肌细胞中呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ含量明显减少(P0.01),而含药血清组心肌细胞中呼吸链复合物Ⅰ含量明显减少(P0.01),呼吸链复合物Ⅱ有所减少(P0.05);与FABP3过表达组比较,含药血清组心肌细胞中呼吸链复合物Ⅰ含量明显增加(P0.01),呼吸链复合物Ⅱ有所增加(P0.05)。4.含可变长度的FABP3启动子质粒进行转染后再予以含益糖康血清干预后,Western-blot检测心肌细胞心肌收缩相关蛋白(SERCA、RYR2、PLB)含量结果显示,与正常对照组相比,FABP3过表达组和含药血清组心肌细胞中的SERCA含量明显减少(P0.01);与FABP3过表达组比较,含药血清组心肌细胞中的SERCA含量则有明显提高(P0.01)。与正常对照组相比,FABP3过表达组和含药血清组心肌细胞中的RYR2含量有所降低(P0.05);与FABP3过表达组比较,含药血清组心肌细胞中的RYR2含量则有明显升高(P0.01)。与正常对照组相比,FABP3过表达组和含药血清组心肌细胞中的PLB含量明显增加(P0.01);与FABP3过表达组比较,含药血清组心肌细胞中的PLB含量则有明显降低(P0.01)。5.含可变长度的FABP3启动子质粒进行转染后再予以含益糖康血清干预后,Western-blot检测心肌细胞脂肪酸氧化相关蛋白(CPT-1、CPT-2)含量结果显示,与正常对照组相比,FABP3过表达组心肌细胞中的CPT-1含量明显减少(P0.01),含药血清组心肌细胞中的CPT-1含量有所降低(P0.05);与FABP3过表达组比较,含药血清组心肌细胞中的CPT-1含量则有明显升高(P0.01)。与正常对照组相比,FABP3过表达组和含药血清组心肌细胞中的CPT-2含量明显减少(P0.01);与FABP3过表达组比较,含药血清组心肌细胞中的CPT-2含量则有明显升高(P0.01)。结论:1.在体内实验中,高脂饮食喂养结合链脲佐菌素腹腔注射方法可以有效制备2型糖尿病大鼠模型,减轻模型大鼠体重,提高模型大鼠空腹血糖水平,使之出现三多一少症状,且在本实验中显示出成功率为75%。益糖康可以有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖水平,有效减缓2型糖尿病大鼠体重减少的程度,有效降低2型糖尿病大鼠血清TC、TG、FFA水平,明显提高心肌组织中的ATP含量、有效抑制FABP3表达以提高心肌收缩能力。2型糖尿病大鼠心肌FABP3蛋白表达与心脏射血分数呈负相关;ATP与心脏射血分数呈正相关。2.在体外实验中,高剂量益糖康含药血清可明显提高FABP3过表达的心肌细胞中ATP含量,明显提高FABP3过表达的心肌细胞中线粒体中的呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ含量,提示益糖康可以通过对复合物Ⅰ、Ⅱ转运电子行为具有促进作用,明显提高FABP3过表达的心肌细胞中心肌收缩相关蛋白SERCA、RYR2、PLB的活性含量,明显提高FABP3过表达的心肌细胞中CPT1、CPT2蛋白活性含量。这提示益糖康可以通过改善心肌细胞脂代谢相关蛋白,改善心肌细胞中ATP生成环境,提高ATP生成水平,从而改善心肌细胞的收缩能力。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：
图 1-1 各组大鼠体重柱形图糖尿病模型大鼠空腹血糖的影响明，干预前，与正常对照组比较，各组大鼠空腹血糖均显著升高，高、中、低组之间没有显著差异（P>0.05）。干预 2 周后，与大鼠空腹血糖均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；与模型对照组糖显著降低（P＜0.05），中、低剂量组没有显著差异（P>0.05）显著差异（P>0.05）。干预 4 周后，与正常对照组比较，各组大高（P＜0.05 或 P＜0.01）；与模型对照组比较，高、中剂量组空.01），低剂量组没有显著差异（P>0.05）；低剂量组显著高于高。（见表 1-2，图 1-2）表 1-2 大鼠空腹血糖情况（mmol/l， x s）例数 干预前 干预 2 周 干预 4 10 5.75±0.63 6.31±0.72 6.45±0
图 1-2 各组大鼠空腹血糖柱形图病模型大鼠血脂的影响通过益糖康干预，与正常对照组比较，各组大鼠 TC、；与模型对照组比较，三个剂量组 TC、TG 及 FFA 均显著比较，高剂量组降低最显著（P＜0.05 或 P＜0.01）。（见表 1-3 大鼠血脂情况（mg/dl， x s）例数 TC TG 10 60.86±8.04 68.57±9.09 1810 179.19±14.62**194.06±18.93**64710 99.87±6.99**##106.56±11.72**##396.10 123.82±8.21**##▲▲139.33±10.94**##▲▲491.10 144.44±13.15**##▲157.98±15.56**###▲▲581.
图 1-3 干预后大鼠血清 TC、TG 含量柱形图尿病模型大鼠心肌形态的影响组肌细胞排列规则，细胞大小一致，包浆染色均匀。模型对胞间隙增大，细胞肌浆染色不均，较多细胞胞浆内出现空泡述情况有所改善，且高剂量组更加明显。低剂量组肌细胞排不均，胞浆染色不甚均匀，少数细胞胞浆内可见空泡。（见
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4 郭s
本文编号：2791566
