左金方及其主要成分对SGC7901细胞上皮间质转化的影响

发布时间：2020-08-13 04:31

【摘要】：一、目的:胃癌的恶性程度高,在早期时即可发生恶性远处转移,是致使胃癌患者诊疗失败的最主要原因之一。大量研究阐明,恶性肿瘤的侵袭以及转移与上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系十分的密切。本实验主要研究左金方及其主要活性成分小檗碱、吴茱萸碱对人胃癌细胞(SGC7901细胞)的迁移侵袭能力以及EMT的一些特征性的标志物的影响,从而为中医药在临床上治疗胃癌及其转移提供实验和理论基础。二、方法:(1)小檗碱抑制SGC7901细胞上皮间质转化的作用及机制研究1、运用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验来检测小檗碱对SGC7901细胞生长增殖的影响,用来确定之后实验研究的小檗碱浓度。2、采取划痕实验方法与transwell的实验方法来检测小檗碱对SGC7901细胞迁移、侵袭能力的影响。3、Real-Time qPCR技术检测小檗碱对SGC7901细胞E-cadherin、N-cadherin基因转录的影响。4、免疫荧光与Western blot实验方法检测E-cadherin、Zo-1、N-cadherin、Vimentin、MMP-9、Snail1等EMT相关蛋白的表达和AKT、pAKT等通路蛋白的表达。5、Western blot检测PI3K/AKT抑制剂(LY294002)和激动剂(IGF-1)单独或与小檗碱联合作用对E-cadherin、N-cadherin及pAKT表达的影响。(2)吴茱萸碱对SGC7901细胞的侵袭迁移能力以及EMT的影响1、MTT实验方法来检测吴茱萸碱具有抑制SGC7901细胞活力影响的作用,同时明确了用来后续实验研究的吴茱萸碱浓度。2、划痕实验方法与transwell的实验方法来检测吴茱萸碱对SGC7901细胞迁移、侵袭能力的影响。3、运用Western blot来检测吴茱萸碱对SGC7901上皮蛋白E-cadherin、间质蛋白N-cadherin的影响作用。(3)左金方及其主要成分小檗碱对SGC7901细胞上皮间质转化的比较1、制备左金方冻干粉,再选用高效液相色谱(HPLC)方法,对比小檗碱对照品,明确左金方冻干粉的纯度和小檗碱含量。2、MTT检测左金方对SGC7901生长的影响。3、通过划痕、transwell的实验方法来研究比较左金方和小檗碱对SGC7901细胞迁移力、侵袭力的影响。4、Western blot试验研究比较左金方和小檗碱对SGC7901细胞E-cadherin、N-cadherin两种蛋白表达的影响。三.结果:(1)小檗碱抑制SGC7901细胞上皮间质转化的作用及机制研究1、MTT结果显示小檗碱对SGC7901生长具有抑制作用,又表现出了一定的时效和量效关系;小檗碱处理作用24 h后,半数抑制浓度(IC_(50))是127μM。10、20、40μM小檗碱对SGC7901细胞活性有抑制作用但杀伤作用弱,故选择此浓度范围做后续实验。2、划痕方法、Transwell实验显示小檗碱能够明显地抑制SGC7901细胞的迁移力与侵袭力,并呈现出浓度依赖性。3、用小檗碱处理作用细胞24h后能明显提高E-cadherin mRNA的表达,且有浓度依赖关系。20μM小檗碱,40μM小檗碱都能够降低N-cadherin mRNA的转录水平(P0.05)。4、免疫荧光及Western bolt检测小檗碱作用SGC7901细胞24h结果显示,小檗碱可以明显增加SGC7901细胞Zo-1,E-cadherin的表达,与之相反,又能减低Vimentin、N-cadherin、Snail1、MMP-9这些蛋白的表达水平。PI3K/AKT通路蛋白情况显示,随着浓度的增加,小檗碱能显著性降低pAKT表达水平。5、Western bolt结果显示将小檗碱40μM加入到已由激活剂IGF-1(100 ng/mL)预处理的SGC7901细胞中作用24 h,与IGF-1单独影响的细胞相对比,不难发现E-cadherin蛋白显著上升,N-cadherin、pAKT等则显著下降。将抑制剂LY294002(10μM)单独或与小檗碱联合作用于SGC7901细胞,各组间E-cadherin、N-cadherin、pAKT的表达差异有统计学意义(P0.05)。(2)吴茱萸碱影响SGC7901细胞侵袭迁移及EMT1、MTT结果显示出吴茱萸碱对SGC7901细胞的杀伤抑制的作用强,且有明显时效和量效关系,吴茱萸碱作用SGC7901细胞24 h的IC_(50)为1.5μM。0.1、0.2、0.4μM吴茱萸碱作用SGC7901细胞的杀伤作用较弱,故选择此浓度范围做后续实验。2、在划痕试验和transwell实验显示,与control组的结果相比较:0.2μM吴茱萸碱,0.4μM吴茱萸碱都能够明显地抑制SGC7901的迁移力、侵袭力。3、Western bolt示:0.1μM、0.2μM、0.4μM的吴茱萸碱作用SGC7901 24h后,EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin这两种蛋白表达却无明显改变。(3)左金方及其主要成分小檗碱对SGC7901细胞上皮间质转化的比较1、HPLC鉴定供试品即制备的左金方冻干粉杂峰少,纯度高,左金方中小檗碱含量较高。根据小檗碱特征峰面积,采用外标一点法计算,测定得每克左金方冻干粉含有0.0985克小檗碱,即约占9.85%。2、MTT结果显示左金方对SGC7901细胞的生长抑制有明显时效和量效关系,对比40μM(16.3 mg/L)小檗碱,165 mg/L(含16.3 mg/L小檗碱)左金方冻干粉对SGC7901细胞抑制作用更强,杀伤率达半数以上。3、划痕方法、transwell的结果都显示,左金方及小檗碱可以显著抑制SGC7901细胞的迁移力、侵袭力,但左金方组与小檗碱组的迁移率、侵袭率却无明显差异。4、Western bolt结果显示:用165 mg/L左金方组与16.3 mg/L小檗碱组这两个组之间的E-cadherin以及N-cadherin的表达量并没有统计学差异。左金方及小檗碱均能明显抑制SGC7901细胞的EMT,且在左金方发挥主要作用的可能为小檗碱。四、结论:1、小檗碱可以明显地抑制SGC7901细胞的侵袭与转移,且通过调节PI3K/AKT通路抑制SGC7901细胞的上皮间质转化。2、吴茱萸碱对SGC7901细胞迁移和侵袭同样有明显抑制作用,但是对EMT并没有明显抑制作用。3、左金方能够抑制SGC7901细胞的生长、侵袭及迁移,而且能抑制SGC7901胃癌细胞上皮间质转分化;除小檗碱、吴茱萸碱外的其他成分也有协同抑制胃癌细胞的作用,但在抑制EMT方面,小檗碱在左金方复方中为最主要的药效成分。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

吴茱萸碱,结构式

1.3.2 吴茱萸碱的药理研究吴茱萸碱（ evodiamine, Evo），它作为中药吴茱萸中最重要的生物碱之一,是吴茱萸的有效活性单体。吴茱萸碱分子式是C19H17N3O（它的分子结构式可见于图1-1),相对分子质量为 303. 36。吴茱萸碱在各个方面都有强大的临床药理作用,具备广泛的药用价值。目前已发现它具有抗癌、降糖、抗炎、镇痛、保护心脏等多种药理学活性。吴茱萸碱抗肿瘤效应强,主要作用多与诱导肿瘤调亡，产生周期阻滞,抑肿瘤浸润转移等有关,当中的作用机制如网络涉及多条通路的激活。谭宇蕙等[64, 65]实验研究证明吴茱萸碱能够杀伤人肝癌细胞 HepG2，诱导其发生凋亡；且发现吴茱萸碱能够通过激活 p53 、上调 P21 达到显著抑制 786-0 肾癌细胞生长的效果。Takada 等[66]就吴茱萸碱对 NF-κB 等多种癌基因活化的影响进行研究, 结

小檗碱,结构式

图 1-2 小檗碱的结构式erine ，BBR ），又可以称为黄连素，它是啉类生物碱。黄连主要是来自于毛茛科中黄小檗碱分子式为 C20H18NO4（它的分子结构床上历来被用来解热，祛毒，消炎，抗肠道碱还拥有扩张血管、抗心律失常、抗血小板药效。小檗碱治疗疾病涵盖多个系统，其中作用用机制可能与干扰细胞周期、诱导细胞凋亡路、影响 IL-8 表达和 PGE2 生成、降低端粒有关[69]。有研究发现小檗碱通过抑制 MMP 力[70]。小檗碱可通过抑制 ERK 通路及 COX1]。此外，小檗碱对正常肝细胞无毒，又能效

小檗碱,生长抑制作用

图 2-1 MTT 法检测小檗碱对 SGC7901 细胞的生长抑制作用小檗碱对 SGC7901 细胞迁移、侵袭能力的影响痕实验结果图 2-2 可显示出，在划痕 24 h 后，空白对照组细胞小，甚至是接近愈合的状态，而小檗碱加药组比对照组细胞缺度增大，缺口愈合情况越差。其中，20μM、40μM 的小檗碱作用的相对迁移率分别为 58.7 ± 4.80%、52.9 ± 4.25% (图 2-2, P < 0够显著抑制 SGC7901 细胞的迁移力。Transwell 实验可表示，孵育 SGC7901 细胞 24 h 后，穿过 Transwell 小室基底膜并明的细胞减少，即细胞侵袭能力有了明显性的降低。通过与对照异具有统计学意义，且呈浓度依赖性。其中 20μM、40μM 的小胞24h 的相对侵袭率分别为62.3 ± 0.19% 、59.6 ± 0.64% (图2碱能够显著抑制 SGC7901 细胞的侵袭能力。

【参考文献】