桔梗介导P2X7r-NLRP3信号通路调控肺纤维化作用机制的研究

发布时间：2020-08-13 01:43

【摘要】：目的:桔梗(Platvcodon grandiflorus,PG)是传统的朝药,具有很好的宣肺作用,桔梗皂苷D(PlarvcodinD PD)为桔梗的主要皂苷成分。本研究结合体内外实验,建立以Raw264.7细胞上清液处理的A549细胞和香烟烟雾方法饲养的小鼠为研究对象的肺纤维化模型,探究桔梗提取物(PG Extract)和桔梗皂苷D对肺纤维化的调控作用及其潜在分子机制。方法:体内实验选用BALB/c雄性小鼠,通过每日暴露于香烟烟雾3h、持续饲养11周建立肺纤维化模型,给药组每天灌胃低中高剂量的桔梗提取物(100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg)和桔梗阜苷 D(20mg/kg)。造模结束后,对肺脏进行石蜡切片、冷冻切片,通过HE染色、Masson染色、Sirius red染色、免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色来观察小鼠肺组织的病理学改变;提取小鼠肺组织的总蛋白、RNA进行蛋白印迹实验和RT-PCR实验,测定α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Toll 样受体-4(toll like receptor-4,TLR4)、嘌吟能离子通道型 7 受体(Purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor,P2X7r)、核苷酸结合寡聚化结构式受体 3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等蛋白和mRNA的表达水平。体外实验选用人肺癌细胞A549,收集脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)1μg/mL刺激Raw264.7细胞4h后的上清液,孵育A549细胞24h后,分别给予桔梗提取物(1O0μg/mL)和桔梗皂苷D(5μM)处理30min,提取细胞总蛋白和RNA进行蛋白印迹实验以及RT-PCR实验,检测TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β等指标的蛋白及mRNA的表达水平。进行细胞免疫荧光染色,观察桔梗提取物和桔梗皂苷D对炎性上清液孵育A549细胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3炎性小体在细胞中的表达情况。结果:体内实验中,HE、Masson等染色结果,表明香烟烟雾组小鼠肺组织肺泡壁明显增厚且伴有间质水肿和胶原纤维沉积等现象,桔梗提取物和桔梗皂苷D组小鼠肺泡结构相对完整,且改善了间质水肿以及减少了胶原纤维沉积的现象;给予桔梗提取物和桔梗皂苷D能抑制香烟模型小鼠中α-SMA、I型胶原蛋白(collagen type I,collagen-I)的表达、抑制 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等蛋白以及mRNA的表达。体外实验中,Raw264.7细胞上清液刺激可引起A549细胞中 α-SMA、Collagen-I 的表达升高,以及 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等指标的表达升高,给予桔梗提取物和桔梗皂苷D能抑制由Raw264.7细胞上清液刺激引起的 α-SMA、Collagen-I 的表达、抑制 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等指标的表达。结论:桔梗提取物和桔梗皂苷D可下调α-SMA、Collagen-Ⅰ的表达改善香烟烟雾诱发小鼠肺损伤、肺纤维化,改善炎性上清(LPS刺激Raw264.7上清液)孵育A549细胞中的炎症因子释放来达到一定的肺脏保护作用。P2X7r可能是桔梗提取物和桔梗皂苷D治疗肺纤维化炎性反应的核心靶点,桔梗提取物和桔梗皂苷D可能通过介导P2X7r-NLRP3信号通路调控肺纤维化的发展进程;通过抑制TLR4信号通路,从而减轻由香烟烟雾或炎性上清刺激引起的炎症反应。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

ａｐｉｏｓｙｌ逡逑图２－１桔梗皂苷Ｄ化学结构式逡逑２．２．３动物培养逡逑选用ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，体重１８？２０ｇ，购于吉林省长春市亿斯实验动物技逡逑术有限责任公司。在延边大学科技楼动物室内词养，温度为１８？２２°Ｃ，采用独立逡逑通气送风系统，给予小鼠自由饮水和饮食。适应一周后，开始造模。逡逑将小鼠随机分为正常组、ＣＳ组、ＣＳ＋ＰＧ－１００ｍｇ／ｋｇ组、ＣＳ＋ＰＧ－２００ｍｇ／ｋｇ组、逡逑ＣＳ＋ＰＧ－３００ｍｇ／ｋｇ组、ＣＳ＋ＰＤ－２０ｍｇ／ｋｇ组，每天给予香烟烟雾前一个小时，开始逡逑对给药组小鼠根据体重进行灌胃，正常组用生理盐水进行灌胃（流程图如逡逑下）。灌胃后一小时，将除了正常组和给予ＰＤ组的小鼠放在一个不完全封闭的逡逑透明箱中，点燃五只香烟（遵义香烟，购于超市里）放入透明箱中，让香烟烧够逡逑１５ｍｉｎ后，打开盖子让小鼠休息５ｍｉｎ，适当休息后，继续给予香烟烟雾，每天逡逑

ＯＨ邋0Ｈ逡逑ａｐｉｏｓｙｌ逡逑图２－１桔梗皂苷Ｄ化学结构式逡逑２．２．３动物培养逡逑选用ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，体重１８？２０ｇ，购于吉林省长春市亿斯实验动物技逡逑术有限责任公司。在延边大学科技楼动物室内词养，温度为１８？２２°Ｃ，采用独立逡逑通气送风系统，给予小鼠自由饮水和饮食。适应一周后，开始造模。逡逑将小鼠随机分为正常组、ＣＳ组、ＣＳ＋ＰＧ－１００ｍｇ／ｋｇ组、ＣＳ＋ＰＧ－２００ｍｇ／ｋｇ组、逡逑ＣＳ＋ＰＧ－３００ｍｇ／ｋｇ组、ＣＳ＋ＰＤ－２０ｍｇ／ｋｇ组，每天给予香烟烟雾前一个小时，开始逡逑对给药组小鼠根据体重进行灌胃，正常组用生理盐水进行灌胃（流程图如逡逑下）。灌胃后一小时，将除了正常组和给予ＰＤ组的小鼠放在一个不完全封闭的逡逑透明箱中，点燃五只香烟（遵义香烟，购于超市里）放入透明箱中，让香烟烧够逡逑１５ｍｉｎ后

延边大学硕士学位论文逦梧梗介导Ｐ２Ｘ７ｒ－ＮＬＲＰ３信号通路调控肺纤维化作用机制的研宄逡逑第三章实验结果逡逑３．１桔梗对Ａ５４９细胞存活率的影响逡逑我们通过ＭＴＴ实验观察不同浓度下的桔梗提取物和桔梗皂苷Ｄ对Ａ５４９细逡逑胞存活率的影响。如图１所示，图Ａ和图Ｂ显示，桔梗提取物（０？１２５ｐｇ／ｍＬ）、逡逑}P梗皂苷Ｄ邋（邋０？５ｊｉＭ邋）对Ａ５４９细胞存活率无影响，但桔梗提取物逡逑（２５０？２００0ｎｇ／ｍＬ）、桔梗皂苷Ｄ（邋１０ｐＭ）显著抑制了邋Ａ５４９细胞存活率（Ｐ＜０．００７邋）。逡逑因此，选择桔梗提取物（１００［ｉｇ／ｍＬ）和桔梗皂苷Ｄ邋（５｜ｉＭ）进行后续实验。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑

【参考文献】

相关博士学位论文 前1条

1 彭旷;P2X7R在动脉粥样硬化中对NLRP3炎症小体的调节作用[D];大连医科大学;2014年

本文编号：2791335