基于免疫亲和色谱的中药多糖活性筛选与构效关系研究

发布时间：2020-08-15 16:46

【摘要】：多糖是由醛糖和(或)酮糖通过糖苷键将单糖连接在一起的一类天然大分子聚合物,是机体生命活动必不可少的物质。糖生物组学已经成为继基因组学、蛋白质组学之后的第3个生物学里程碑。多糖具有多种重要的生物活性,特别是在调节机体免疫、增强细胞抗肿瘤活性等方面。目前对多糖的免疫活性成分的筛选方法是在传统的提取、分离和结构解析的基础上利用药理模型对多糖进行免疫活性测试,但该方法比较繁琐,且耗时较长。巨噬细胞(macrophagocyte,Mφ)是多糖发挥免疫调节作用的最主要的效应细胞,在免疫系统中发挥关键作用。多糖对Mφ的免疫调节作用主要通过对Mφ分泌细胞因子的影响及调节Mφ激活的信号通路两个方面进行。黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是机体催化黄嘌呤或次黄嘌呤转化为尿酸关键酶,同时XOD催化过程中生成的氧自由基影响整个免疫系统:尿酸过多会在关节处沉积,形成炎症,诱发机体的免疫反应;氧自由基也具有调节免疫活性、前列腺素合成、Mφ吞噬等作用。多糖可以通过对XOD的作用,发挥其免疫调节活性。本论文的研究目的是构建复壁碳纳米管修饰的Mφ脂筏免疫亲和色谱系统以及XOD酶免疫亲和色谱系统,实现多糖免疫活性的在线筛选,建立起一套快速、准确、使用寿命长的多糖免疫活性筛选系统。主要研究内容如下:1.Mφ脂筏免疫亲和色谱及XOD免疫亲和色谱在线筛选模型的构建:1)亲和色谱固定相材料的制备:首先将酰化的复壁碳纳米管(Carbon Nanotube Multi-walled,CNTm)与硅烷化的硅胶反应制备复壁碳纳米管包裹的硅胶(CNTm@SiO_2)。将人单核细胞(monocytes,THP-1)诱导分化成Mφ,采用蔗糖梯度密度溶液超速离心法,获取脂筏;在冰浴条件下,分别向Mφ脂筏溶液、XOD溶液中加入CNTm@SiO_2,制备Mφ包裹的CNTm@SiO_2色谱固定相(Mφ@CNTm@SiO_2)及XOD包裹的CNTm@SiO_2色谱固定相(XOD@CNTm@SiO_2)。扫面电子显微镜表征及免疫活性检测等结果表明:提取脂筏活性稳定,制备成固定相后,脂筏及XOD很好的吸附于CNTm@SiO_2表面,且XOD与脂筏的免疫活性基本没受影响。2)亲和色谱系统的性能考察:采用低压装柱法制备亲和色谱柱,并对其免疫亲和色谱系统进行考察。分别考察Mφ@CNTm@SiO_2色谱固定相及色谱系统、XOD@CNTm@SiO_2色谱固定相及色谱系统的稳定性、专属性和使用寿命。实验结果显示色谱系统的稳定性和专属性良好,连续在线使用240 h后,其色谱活性没受影响,色谱柱活性保持良好,且使用寿命与未修饰的脂筏色谱相比大大延长。3)对不同分子量葡聚糖在这两种色谱上的保留行为分别进行研究,发现葡聚糖分子量的Ln值与其在色谱系统的保留时间成反比,回归方程的线性关系良好,为后续多糖筛选和免疫活性强弱判断奠定基础。2.中药多糖免疫活性在线筛选研究:选取十五味中药材,利用有机溶剂先除色素,经水提醇沉及除蛋白得到粗多糖,再利用大孔树脂层析柱、离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱对粗多糖进一步分离纯化,得到分子量相对均一的纯化多糖组分17个,利用亲和色谱在线活性筛选模型筛选多糖的免疫活性。1)多糖的分离纯化:药材用石油醚和无水乙醇脱色后,超纯水提取浓缩后用95%乙醇沉淀多糖,沉淀物用Sevage法除蛋白质,超纯水透析两天,得到十五味中药的粗多糖。利用AB-8、D-101和D-315型大孔吸附树脂对粗多糖进行脱色。最后,将脱色后的粗多糖依次用离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱进行纯化,得到分子量相对均一的纯化多糖。2)多糖纯度鉴定:采用紫外分光光度法测定纯化多糖的纯度,元素分析仪对纯化多糖进行元素含量检测;采用高效液相色谱对多糖的纯度及分子量的进行测定。综合分析纯度检测结果,可证实所分离纯化的多糖分子量均相对均一,几乎均不含蛋白质、核酸、小分子化合物、色素、无机盐等杂质,多糖的纯度均较高。3)多糖含量测定:采用苯酚-硫酸法对多糖的总糖含量进行检测。以葡聚糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线:y=8.177x-0.0414,R2=0.9976,线性范围良好。分离纯化得到的17种多糖的总多糖含量均超过98.5%。4)蛋白质含量测定:采用考马斯亮蓝法检测蛋白质含量。以牛血清蛋白浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,标准曲线:y=0.0299x+0.0028,R~2=0.9901,线性关系良好。分离纯化得到的17种多糖的蛋白质含量均未超过0.5%。5)纯化多糖免疫活性在线筛选:分别用Mφ@CNTm@SiO_2色谱系统及XOD@CNTm@SiO_2色谱系统对多糖的免疫活性进行在线筛选。通过与多糖在Mφ@CNTm@SiO_2免疫亲和色谱柱上的理论保留时间相比较,发现金银花-2多糖、川牛膝多糖、黄芩多糖、苦参多糖、当归多糖、金针菇多糖、白芍-1多糖在Mφ@CNTm@SiO_2免疫亲和色谱柱上实际保留时间明显延迟;通过与多糖在XOD@CNTm@SiO_2免疫亲和色谱柱上的理论保留时间相比较,金银花-2多糖、川牛膝多糖、黄芩多糖、苦参多糖、金针菇多糖、白芍-1多糖、白芍-2多糖在XOD@CNTm@SiO_2免疫亲和色谱柱上的实际保留时间明显延迟。3.中药多糖免疫活性体内外评价采用体内体外结合的方法检测多糖对XOD和Mφ活性的影响,验证Mφ@CNTm@SiO_2免疫亲和色谱以及XOD@CNTm@SiO_2免疫亲和色谱在线筛选多糖免疫活性结果的准确性。1)多糖对体外培养的Mφ吞噬的影响:采用紫外分光光度法来考察多糖对Mφ的吞噬的情况。研究结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组均可以显著影响Mφ的吞噬行为。2)多糖对Mφ分泌的NO和TNF-α的影响:ELISA试剂盒检测结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组、当归多糖组均可以显著提高NO、TNF-α分泌量;黄芪多糖组显著提升Mφ分泌NO的能力。3)多糖对体内Mφ吞噬能力影响:采用小鼠腹腔Mφ吞噬鸡红细胞试验测定多糖对Mφ体内吞噬能力的影响。实验结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组的小鼠Mφ吞噬能力显著提高。4)纯化多糖的体外抑制XOD活性研究:用紫外分光光度法检测尿酸的含量,推断多糖对XOD抑制活性。研究结果:金银花-2多糖、川牛膝多糖、黄芩多糖、苦参多糖、金针菇多糖、白芍-1多糖、白芍-2多糖有抑制XOD的活性。5)多糖在体内对XOD抑制活性研究:建立高尿酸症大鼠模型,检测纯化多糖对大鼠的血清及肝脏中XOD活性的影响,研究结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组可以显著降低血清及肝脏中XOD的活性。6)纯化多糖对大鼠血尿酸水平影响:大鼠高尿酸血症模型的建立,可以通过检测尿酸浓度,在一定程度上反应多糖对XOD的抑制活性。研究结果表明,金银花-2多糖组、川牛膝多糖组、黄芩多糖组、苦参多糖组、金针菇多糖组、白芍-1多糖组、白芍-2多糖组、山药多糖组、黄芪多糖组、白芨多糖组可明显降低大鼠血尿酸浓度。通过以上实验证明建立的两种亲和色谱具有可靠的多糖免疫活性筛选能力,采用阴性对照品葡聚糖所建立的半定量分析方法准确性高。4.多糖的结构解析及构效关系初步探讨本章对分离纯化的17种多糖的结构进行初步解析,主要采用高效液相、红外光谱、核磁共振、高碘酸氧化、刚果红实验等分析方法和分析仪器。对多糖的初级及高级结构进行研究,结合前期多糖的免疫活性的测定,初步探索多糖的构效关系。1)多糖分子量与活性关系:在一定范围内,大分子量的多糖具有更多数量的单糖,糖键的连接方式更多,聚合种类也更多,所以空间结构更加复杂,有可能会提高其生物活性。2)单糖组成与活性关系:采用柱前衍生化-高效液相色谱法对多糖的单糖组分进行检测。研究发现,具有葡聚糖主链结构,含有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖的多糖具有较强的促进免疫活性作用;糖醛酸可以明显增加多糖的免疫活性。3)糖苷键的类型与活性关系:采用高碘酸氧化多糖反应分析糖苷键连接类型。研究发现,免疫活性强的多糖中的1→3糖苷键所占比例比其他纯化多糖组分的比列高。推测可能是因为1→3糖苷键为非还原性糖苷键,其比例越大,稳定性和耐受性越高,活性所受影响越小。4)异头碳类型与活性的关系:采用傅里叶变换-红外光谱分析及~1H-NMR分析异头碳类型。结果表明,异头碳的联合类型与多糖免疫活性大小的关系不明显。5)多糖高级结构与活性的关系:采用刚果红实验以及透射电镜分析多糖的高级构象。研究表明,具有三螺旋空间构象的多糖其免疫活性相应较强,而透射电镜的分析结果也证明这几个纯化多糖具有类似蠕虫链状的空间构象,与其三螺旋空间构象类似。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.7;R284
【图文】：

硅胶,脂筏,荧光

图 2.1 硅胶及 CNTm@SiO2SEM 图Fig 2.1 SEM images of silica gel and CNTm@SiO2 脂筏的表征图 2.2 所示，由脂筏的免疫组化结果可得，Mφ脂筏特异性的荧光（表明该方法制备的脂筏具有免疫活性。图 2.2 脂筏荧光倒置显微镜图观察 Mφ脂筏特异性的荧光（CD80）Fig 2.2 fluorescence inverted microscope images of lipid rafts

脂筏,荧光,倒置显微镜,免疫活性

图 2.1 硅胶及 CNTm@SiO2SEM 图Fig 2.1 SEM images of silica gel and CNTm@SiO23.2 M 脂筏的表征如图 2.2 所示，由脂筏的免疫组化结果可得，Mφ脂筏特异性的荧光（CD80）显著，表明该方法制备的脂筏具有免疫活性。

HPLC色谱,尿酸,线性回归方程,色谱条件

图 2.4：SiO2、CNTm@SiO2、Mφ@CNTm@SiO2的激光共聚焦图Fig 2.4 Confocal images of SiO2、CNTm@SiO2、Mφ@CNTm@SiO23.5 XOD 与 XOD@CNTm@SiO2酶活性评价按照本章“2.7 项”进行尿酸体外标曲的建立：得到其线性回归方程为：A=749675C+53354，R2=0.999，按本章“2.7 项”的色谱条件下测得的尿酸 HPLC色谱图见图 2.5。

【相似文献】