蟾毒灵对肾癌细胞ACHN的作用及机制研究

发布时间：2020-08-17 11:56

【摘要】：研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),简称肾癌,是一种常见的恶性肿瘤,约占成人恶性肿瘤的2%-3%,并以每年近2%的速度增长。随着早期诊断技术的发展和治疗手段的革新,人们对肾癌的认识越来越多,但是目前仍然有1/3的病人初诊时为晚期肾癌(metastasis RCC,mRCC)。更让人心痛的是,仍有多于1/3的早期局灶性肾癌病人在行肾癌切除术后最终发展为进展期肾癌。目前手术治疗仍然是肾癌的首选治疗方案,但是对于晚期肾癌病人由于对放化疗不敏感,在已经失去了根治性手术机会的时候,减瘤手术联合靶向治疗药物或许可以延长预后。尽管对肾癌的认识越来越全面、治疗肾癌的手段越来越多,肾癌的预后仍然不容乐观,总中位生存时间少于1年。严峻的现实急迫的需要我们加强对肾癌发生的生物学机制以及相关信号通路的理解,以期发现新的治疗靶点。蟾毒灵是传统中药蟾酥的有效成分之一,目前已被多项研究证实对肺癌、肝癌、前列腺癌和宫颈癌等有抗肿瘤作用。上述研究提示蟾毒灵是一个潜在的肿瘤靶向治疗的有意义靶点。但是关于蟾毒灵对肾细胞癌的作用未见相关研究。在本研究中,我们试图阐述蟾毒灵对肾癌ACHN细胞的作用及潜在的机制。目的探讨蟾毒灵对肾癌ACHN细胞的生物学行为的影响并探索其可能的作用机制;为肾癌的治疗寻找新的方法和思路。方法1.蟾毒灵对肾癌ACHN细胞株的作用1.1.CCK-8法检测蟾毒灵对肾癌ACHN细胞的增殖能力的作用1.2.平板克隆形成实验检测蟾毒灵对肾癌ACHN细胞集落形成能力的作用1.3.流式细胞仪检测蟾毒灵对肾癌ACHN细胞周期及凋亡进程的作用1.4.划痕实验、Transwell迁移实验和侵袭实验检测蟾毒灵对肾癌ACHN细胞转移能力的影响2.蟾毒灵对肾癌ACHN细胞株作用机制研究2.1.PCR分析在蟾毒灵处理前后ACHN细胞内AKT、E-cadherin和N-cadherin基因表达量的变化2.2.IF细胞免疫荧光法明确E-cadherin蛋白在蟾毒灵处理前后ACHN细胞内表达位置的改变和表达量的变化2.3.Western blot分析在蟾毒灵处理前后ACHN细胞内周期蛋白、转移相关蛋白和PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达量的改变结果1.蟾毒灵对肾癌ACHN细胞株的作用1.1.蟾毒灵明显抑制ACHN细胞增殖,12h、24h、48h和72h对应的IC50分别为 228.08±9.64,29.41 ±2.60,10.49±0.79,6.7±0.97nM。1.2.蟾毒灵明显抑制ACHN细胞集落形成能力,和对照组相比随着蟾毒灵浓度的增加,克隆形成数从233.00 ± 12.12个减少到183.67 ± 5.69,94.33 ± 5.86和65.33±4.51个p0.05),而且随着浓度增加,克隆形成的范围越来越小。1.3.蟾毒灵阻滞ACHN于G2/M期,但无明显促凋亡作用。在不同浓度蟾毒灵(0、5、10、20nM)处理24h后,处于G2/M期的细胞从7.86±0.96%显著增加到了15.49±3.51%,23.38±2.98%和 37.07±7.05%(p0.05)。1.4.蟾毒灵明显抑制ACHN细胞迁移、侵袭能力,随着蟾毒灵浓度的增加,ACHN细胞划痕迁移率、Transwell迁移细胞数和侵袭细胞数都明显下降(p0.01)。2.蟾毒灵对肾癌ACHN细胞作用机制研究2.1.QT-PCR结果显示E-cadherin基因的表达水平在20nM蟾毒灵作用24h后的ACHN内显著升高,而N-cadherin则显著下降;但是Akt基因的表达量无显著变化。2.2.细胞免疫荧光结果显示E-cadherin蛋白在20nM蟾毒灵作用24h后的ACHN细胞膜上表达量明显增加。2.3.在蟾毒灵作用24h后,Western blot提示ACHN细胞内CDK1、Cyclin B1表达量明显下降(p0.05),p21明显上升(p0.05;E-cadherin明显上升(p0.05),N-cadherin 和 HIF-1α 明显下降(p0.05);PI3K、p-Akt 和 p-mTOR 明显下降(p0.05),t-Akt 无明显变化(p0.05)。结论1.蟾毒灵对肾癌ACHN细胞有生长抑制作用。2.蟾毒灵阻滞肾癌ACHN细胞周期于G2/M期,抑制ACHN细胞集落形成、迁移和侵袭。3.蟾毒灵可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗肿瘤作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

如图３邋Ｂ在不同浓度蟾毒灵（０、５、１０、２０ｎＭ）处理２４ｈ后，处于Ｇ２／Ｍ逡逑期的细胞从邋７．８６±０．９６％邋显著增加到了邋１５．４９±３．５１％，２３．３８±２．９８°／0邋和逡逑３７．０７±７．０５％邋（ｐ＜０．０５）。而相同浓度作用相同时间后，如图１－３Ｃ所示流式逡逑细胞仪检测ＡＣＨＮ凋亡细胞数相对于对照组无明显增加（ｐ＞０．０５）。同时我逡逑们增加蟾毒灵浓度和时间后，ＡＣＨＮ细胞处于早期凋亡细胞数仍无明显增加，逡逑而处于晚期凋亡即ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ和ＰＩ均为阳性的细胞明显增加。Ａｎｎｅｘｉｎ逡逑Ｖ邋ＦＩＴＣ和ＰＩ均为阳性的细胞可能为凋亡细胞，也可能为各种因素导致的死逡逑亡细胞

２．５．蟾毒抑制肾癌ＡＣＨＮ细胞迁移、侵袭能力逡逑在细胞划痕实验中，不同浓度蟾毒灵（０、１０、２０ｎＭ）处理ＡＣＨＮ细胞逡逑２４ｈ后，ＡＣＨＮ细胞划痕迁移率如图１－４邋Ａ、Ｂ从７８．６０±３．３８％下降到逡逑５２．７５±２．５５％和邋１２．３６±０．８７％邋（ｐ＜０．０５）。而在邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋迁移和侵袭实验中，逡逑不同浓度蟾毒灵（０、１０、２０ｎＭ）作用于ＡＣＨＮ细胞后，如图１－４邋Ｃ、Ｄ所逡逑示无基质胶的小室中下室的细胞数从２８４．６７±１４．５７下降到１５４．００７．９４±和逡逑４４．６７±２．０８邋（ｐ＜０．０５）；有基质胶的小室中下室的细胞数从１６４．３３士１４．５７下降逡逑１７逡逑

逦ｌＯｎＭ逦２０ｎＭ逡逑图１－３．蟾毒灵阻滞ＡＣＨＮ细胞于Ｇ２／Ｍ期逡逑Ａ：不同浓度蟾毒灵作用２４ｈ后ＡＣＨＮ细胞处于各细胞周期的细胞数；Ｂ：随着浓度增逡逑力口，处于Ｇ２／Ｍ期的细胞数明显增加（＊ｐ＜０．０５，邋Ｎ＝３）；邋Ｃ：不同浓度蟾毒灵作用２４ｈ逡逑后，流式细胞仪检测到的凋亡ＡＣＨＮ细胞数无明显增多。逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ａｒｒｅｓｔ邋ａｔ邋Ｇ２／Ｍ邋ｉｎ邋ＡＣＨＮ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：邋Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｐｈａｓｅｓ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．邋Ｂ：邋Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ逡逑ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋Ｇ２／Ｍ邋ｐｈａｓｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＤ邋（＊Ｐ邋＜逡逑０．０５，邋Ｎ＝３）．邋Ｃ：Ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋ｆｏｒ邋２４ｈ，邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｉｄｎｏｔ邋ｉｎｃｒｅａｓｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．逡逑２．５．蟾毒抑制肾癌ＡＣＨＮ细胞迁移、侵袭能力逡逑在细胞划痕实验中，不同浓度蟾毒灵（０、１０、２０ｎＭ）处理ＡＣＨＮ细胞逡逑２４ｈ后，ＡＣＨＮ细胞划痕迁移率如图１－４邋Ａ、Ｂ从７８．６０±３．３８％下降到逡逑５２．７５±２．５５％和邋１２．３６±０．８７％邋（ｐ＜０．０５）。而在邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋迁移和侵袭实验中，逡逑不同浓度蟾毒灵（０、１０、２０ｎＭ）作用于ＡＣＨＮ细胞后

【参考文献】

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1 柯鑫文;胡志全;;晚期肾癌靶向治疗的作用机制 耐药机制与对策[J];中国肿瘤临床;2015年24期

2 黄立中;张慧;田莎;李俊俊;张远;;六神丸对食管癌移植瘤细胞凋亡指数及B淋巴细胞瘤-2基因的影响[J];吉林中医药;2015年01期

3 黄后宝;夏东东;沈群山;程庆水;王啸;邱腾;;蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响[J];中国临床药理学与治疗学;2014年07期

4 徐文达;高平;杨文君;;p53信号通路与肿瘤关系的研究进展[J];宁夏医科大学学报;2012年09期

5 李锋;马志方;;蟾蜍灵对前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的作用及其机制[J];中华临床医师杂志(电子版);2011年22期

6 张明;孟和宝力高;郭兰英;赵艾润;;p21基因与肿瘤的研究进展[J];中国煤炭工业医学杂志;2011年09期

7 周凯;葛京平;高建平;张征宇;周文泉;;213例偶发肾癌的临床特点及预后分析[J];中国癌症杂志;2011年08期

8 闫海龙;龚勇珍;;氧化应激及p16和p53/p21与细胞衰老关系的研究进展[J];医学综述;2011年05期

9 张可华;宋建国;;EMT与肿瘤[J];生命的化学;2008年05期

10 李向荣;林星余;肖忠秀;蒋海霞;唐琼兰;刘馨;;p21结构功能与研究新进展[J];医学综述;2008年14期

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本文编号：2795289