细叶远志皂苷调节细胞自噬抗Aβ诱导细胞损伤的作用及机制

发布时间：2020-08-17 12:23

【摘要】：细叶远志皂苷(Tenuifolin,Ten)是从远志中提取的主要活性成分。中药远志(Polygala tenuifolia)具有安神益智的功能,传统上常用于提高记忆力和治疗痴呆症。有研究表明,远志具有减少Aβ异常沉积,抑制Tau蛋白磷酸化,调节胆碱酯酶系统功能,减少炎性介质的产生,抑制谷氨酸过度释放引起的神经毒性,抗氧化和抑制细胞凋亡等作用,从而发挥抗AD及神经保护作用。但Ten发挥抗AD活性的具体作用和分子机制还有待进一步阐明,尤其是Ten对Aβ产生及Aβ毒性作用的影响和分子机制。本论文研究了Ten通过调控细胞自噬在抗Aβ诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用,探讨了Ten调控自噬信号通路的分子机制,为细叶远志皂苷应用于AD治疗提供新的靶点和科学依据。具体内容如下:1、Ten调节细胞自噬对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞形态和活力的研究:MTT法检测细胞活力,结果显示,50μM Ten可以改善SH-SY5Y细胞中20μM Aβ25-35诱导的细胞形态和提高Aβ25-35诱导的细胞活力,而自噬抑制剂3-MA能拮抗Ten的保护作用。结果表明Ten通过激活自噬改善了Aβ25-35诱导的细胞形态损伤和细胞活力下降。2、Ten调节细胞自噬对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的研究:DCFH-DA荧光探针测定ROS水平,硫代巴比妥酸(TBA)测定MDA水平,WST-8法测定SOD活性,NADPH法测定GSH-Px活性,紫外线吸收法测定CAT活性,结果显示,Ten能够降低Aβ25-35诱导ROS和MDA浓度,并提高SOD、GSH-Px及CAT的活性,而加入自噬抑制剂3-MA会拮抗Ten的抗氧化作用。结果表明,Ten通过激活自噬减轻Aβ25-35诱导产生的氧化应激损伤,提高了细胞抗氧化能力。3、Ten调节细胞自噬对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞炎症反应的研究:RT-PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-ɑm RNA的表达水平变化,结果显示,Ten能降低Aβ25-35诱导的IL-1β、IL-6和TNF-ɑm RNA的表达水平,而加入3-MA会拮抗Ten的抗炎作用。结果表明,Ten通过激活自噬显著减轻SH-SY5Y细胞中Aβ25-35诱导的炎症损伤。4、Ten调节细胞自噬对SH-SY5Y细胞中Aβ产生的研究:RT-PCR检测APP和BACE1 m RNA的表达水平变化,Elisa检测BACE1、Aβ_(1-40)和Aβ1-42水平,结果显示,Ten能显著降低SH-SY5Y细胞中Aβ25-35诱导的BACE1 m RNA的表达水平和BACE1、Aβ_(1-40)和Aβ1-42的浓度,而Ten和Aβ25-35对APP m RNA的表达水平无显著影响,加入3-MA会拮抗Ten减少Aβ产生的作用。结果表明,Ten通过激活自噬抑制SH-SY5Y细胞中BACE1的活性,从而减少Aβ产生。5、Ten对Aβ诱导细胞自噬的分子机制研究:RT-PCR和western检测Beclin-1、LC3、m TOR、AMPK和ULK1 m RNA及蛋白水平变化,结果显示,Aβ25-35能增加SH-SY5Y细胞中Beclin-1、LC3 m RNA和Beclin-1蛋白水平的表达,不影响LC3-II/I的值,Ten能进一步增加Aβ25-35诱导的Beclin-1和LC3的表达,而3-MA能抑制Ten诱导自噬的作用。Aβ25-35能减少SH-SY5Y细胞中AMPK和ULK1 m RNA及蛋白的表达水平,增加m TOR m RNA及蛋白的表达水平,而Ten能增加AMPK和ULK1的表达,减少m TOR的表达。结果表明,Ten可能通过调控AMPK/m TOR/ULK1通路和增加Beclin-1及LC3-II/I的表达而增强细胞自噬水平。综上所述,Ten能抑制Aβ诱导的神经细胞毒性,其分子机制可能是:Ten通过调控AMPK/m TOR/ULK1通路,增加Beclin-1及LC3-II/I蛋白水平激活自噬,从而降低BACE1活性和减少Aβ分泌,进而改善Aβ25-35诱导的细胞形态损伤和细胞活力下降,提高细胞抗氧化应激能力,减轻炎症损伤,发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

自噬,细胞

Ten+Aβ+3-MA 组图 2-1 Ten 调节细胞自2.4.2 Ten 调节细胞自噬对 Aβ诱导的细胞用 MTT 法研究 Ten 和 3-MA 对 SH与 Aβ25-35(20 μM)共同培养 24h，用 MTAβ(20 μM)作用于 SH-SY5Y 细胞 24h 后control)，Ten(50μM)单独作用对细胞活胞活力，但与对照组相比无显著性差异制剂 3-MA(10mM)共孵育 2 h，再用 Aβ力，结果显示，Ten(50 μM)+Aβ(20μM)组

自噬,细胞,活力,二氢荧光素

Ten 调节细胞自噬对 Aβ诱导的 SH-SY5Y 细胞活力的影响 (与对照组比较：**P<0.01；与 Aβ组比较：#P<0.05，##P<0.0细胞自噬对 Aβ诱导的 ROS 和 MDA 的影响节细胞自噬对 Aβ诱导的 SH-SY5Y 细胞中 ROS 水平 Ten 对 Aβ诱导的 SH-SY5Y 细胞中 ROS 产生的影响M 的 3-MA 预处理细胞 2h，再加入 20μM 的 Aβ25-35二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针预孵育 30三次后用荧光酶标仪检测 ROS 的产生量。结果如图 β能显著增加 SH-SY5Y 细胞中 ROS 的产生(*P<0.05 en 能显著减少 ROS 的产生(#P<0.05 vs Aβ model)，而的产生。结果表明，Ten 能激活自噬减少 Aβ诱导的 R

自噬,细胞,说明书

细胞自噬对 Aβ诱导的 SH-SY5Y 细胞中 ROS 水平的组比较：*P<0.05，**P<0.01；与 Aβ组比较：#P<0.05细胞自噬对 Aβ诱导的 SH-SY5Y 细胞中 MDA 水en 对 Aβ诱导的 SH-SY5Y 细胞中 MDA 产生的养 12h，用 50μM 的 Ten 和 10mM 的 3-MA 预处5-35共同作用 24h，按照 MDA 检测试剂盒说明书与对照组相比，Aβ能显著增加 SH-SY5Y 细胞中ntrol)，与 Aβ组相比，Ten 能显著减少 MDA 的产生A 能进一步增加 MDA 的产生。结果表明，Ten 水平。

【参考文献】