丹参防治阿尔茨海默病的细胞代谢组学和跨血脑屏障转运机制研究

发布时间：2020-08-17 16:00

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种退行性神经系统疾病,迄今为止尚无明确的发病机制和有效的治疗方法。AD的发病机制学说有β淀粉样斑块沉积、Tau蛋白磷酸化、神经炎症、线粒体功能障碍和氧化应激等假说。体内β淀粉样蛋白(amyloid-βprotein,Aβ)有多种肽段,常见的为Aβ_(42)和Aβ_(40),其中Aβ_(42)具有更高的神经毒性,可诱导细胞的凋亡、氧化应激和炎症反应等。目前,AD的治疗药物仅用于改善认知功能,且单靶点药物治疗在临床上表现出有限的疗效,尚无根治方法。中药在AD的临床治疗中发挥着重要角色,中药活性成分治疗中枢系统性疾病,需要跨血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)转运至脑部靶标部位。BBB是存在于脑组织和血液之间由星形胶质细胞足突、脑微血管内皮细胞及其基底膜组成的具有选择功能的屏障。BBB上存在多种转运外排蛋白,例如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等,这些转运蛋白作为主动的外排泵,可以将底物从大脑实质中排出,保护大脑免受有毒物质的侵害,另一方面,通过限制某些药物转运至大脑,降低药物的治疗效果,对维持大脑平衡态具有重要作用。中药丹参是唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge.)的干燥根及根茎,在AD的临床治疗中使用频次较高。然而,丹参治疗AD的机制尚未明确,跨BBB转运的情况也未知。为此,本文进行了三个方面的研究:1、基于UHPLC-QTOF/MS的细胞代谢组学对丹参保护AD模型细胞的机制研究目的:探寻AD有关的潜在生物标志物,阐明丹参对AD细胞模型的保护作用机制。方法:制备Aβ_(1-42)寡聚体,用其诱导人脑微血管内皮细胞(hBMEC)损伤建立AD细胞模型,并评价丹参提取液对模型的保护作用。采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UHPLC-QTOF/MS)结合偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的方法,找寻与AD细胞模型相关的差异代谢物并对其进行鉴别。通过分析代谢通路,阐明丹参对AD细胞模型的保护作用机制。结果:(1)将Aβ_(1-42)多肽单体采用4℃孵育24 h成功制备得到Aβ_(1-42)寡聚体,用10μM Aβ_(1-42)寡聚体诱导细胞损伤,建立AD细胞模型;100μg/mL丹参提取液能显著地提高模型细胞的活性。(2)筛选出33个与AD模型细胞有关的潜在生物标志物。在丹参保护作用下,大部分生物标志物恢复到正常细胞水平。(3)发现AD模型细胞与丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和甘油磷酸代谢等通路的紊乱密切相关。结论:Aβ_(1-42)寡聚体诱导的AD细胞模型与上述代谢通路的紊乱密切相关;丹参提取液对细胞模型的保护作用可能与参与上述代谢途径的调节有关;本研究使用细胞代谢组学的方法阐明中药丹参对AD细胞模型的保护作用机制,尚属首次。2、基于体外BBB模型的丹参多成分跨膜转运研究目的:探讨丹参多种成分跨BBB转运机制,阐明丹参成分与转运蛋白间的关系。方法:利用hBMEC细胞建立BBB单层细胞模型,并进行评价。选择合适浓度的丹参多成分丹参酮IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮、咖啡酸、原儿茶醛和原儿茶酸进行跨BBB转运实验,并通过建立的转运体系中丹参多成分的高效液相色谱串联三重四级杆质谱(HPLC-QQQ/MS)定量方法检测上述多成分的含量,分析各成分跨BBB转运情况。结果:采用hBMEC细胞建立BBB细胞模型的跨膜电阻值为33.04±5.02Ω·cm~2,荧光素钠的通透系数为(3.42±0.47)×10~(-5) cm/s;同时P-gp抑制剂维拉帕米可以抑制罗丹明123在该模型中的外排,增加罗丹明123在该模型中的吸收。建立HPLC-QQQ/MS对转运体系(HBSS)中7种丹参成分含量的检测方法,专属性好,准确度和精密度、基质效应符合要求;本研究中丹参酮IIA、二氢丹参酮I、隐丹参酮、咖啡酸、原儿茶醛和原儿茶酸的Papp_((AP-BL))分别为(3.757±1.723)×10~(-8)、(4.643±2.012)×10~(-6)、(4.977±1.587)×10~(-6)、(2.147±1.010)×10~(-5)、(1.516±0.179)×10~(-5)和(4.369±1.410)×10~(-5) cm/s,上述化合物分别与P-gp抑制剂维拉帕米或BCRP抑制剂Ko143配伍作用后,外排率(ER)均没有显著性变化,且ER均小于2。结论:中药丹参的活性成分丹参酮IIA、二氢丹参酮I、隐丹参酮、咖啡酸、原儿茶醛和原儿茶酸在BBB细胞模型中可以跨膜转运,且不受P-gp和BCRP抑制剂的影响,上述化合物在BBB模型上的吸收可能为单纯的透细胞被动转运。3、大鼠血浆及脑组织中丹参6种成分含量测定及跨血脑屏障转运研究目的:探讨丹参成分在动物体内跨BBB转运情况,阐明丹参成分与转运蛋白间的关系。方法:建立血浆和脑组织中丹参多成分的HPLC-QQQ/MS定量方法,采用液液萃取方式处理血浆样品和脑组织样品,梯度洗脱,流速为0.400 mL/min,采用双内标进行定量,质谱采用多反应监测模式。36只大鼠随机均分为对照组和抑制剂组,抑制剂组大鼠腹腔注射维拉帕米(40 mg/kg,1 mL/200g),对照组大鼠腹腔注射生理盐水(1 mL/200g),60分钟后,所有大鼠均灌胃丹参提取物(25 g/kg,4 mL/200 g)。分别在灌胃丹参提取液后30、60和90分钟,按照给药顺序各收集6只对照组、6只抑制剂组大鼠的血浆和脑组织。通过测定样品中丹参各成分含量,分析其跨血脑屏障转运情况,并评价P-gp抑制剂维拉帕米对丹参成分跨血脑屏障转运的影响。结果:血浆和脑组织HPLC-QQQ/MS方法中6个成分的专属性良好,日内和日间精密度RSD均小于13.72%,基质效应为72.49-138.29%,稳定性符合要求;对照组大鼠血浆中能检测到隐丹参酮、二氢丹参酮I、丹参酮I、咖啡酸和原儿茶酸,与对照组相比,抑制剂组大鼠血浆中隐丹参酮含量升高,而二氢丹参酮I、丹参酮I、咖啡酸和原儿茶酸的含量降低。对照组大鼠脑组织中仅检测到隐丹参酮、二氢丹参酮I和丹参酮I;与对照组相比,抑制剂组大鼠脑组织中隐丹参酮、二氢丹参酮I和丹参酮I的含量和脑血比均降低。结论:隐丹参酮、二氢丹参酮I和丹参酮I可以跨血脑屏障转运,而咖啡酸和原儿茶酸不能跨BBB向脑组织转运。综上所述,丹参对AD模型细胞的保护作用,进一步验证说明其临床治疗效果。丹参酮IIA、二氢丹参酮I、隐丹参酮、咖啡酸、原儿茶醛和原儿茶酸可以跨BBB细胞模型转运,P-gp和BCRP抑制剂均不影响其体外跨膜转运;在动物体内,仅隐丹参酮、二氢丹参酮I和丹参酮I可以跨血脑屏障转运,虽然有研究认为隐丹参酮是P-gp底物,但是本研究发现P-gp抑制剂维拉帕米能降低隐丹参酮、二氢丹参酮I和丹参酮I的脑血比。本研究认为二氢丹参酮I、丹参酮I、咖啡酸和原儿茶酸可能不是P-gp底物。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

寡聚体,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,细胞

1-42寡聚体 SDS-PAGE 凝胶电泳-考马斯horesis-coomassie brilliant blue staining o胞模型聚体作用于 hBMEC 细胞 24 h，经 MT条件下的 Aβ1-42寡聚体能显著性降低 h关性，即 Aβ1-42寡聚体浓度越高，作用献调研，为使细胞能保持一定活性，选型细胞，进行后续实验。

寡聚体,细胞活性,细胞,对照组

Aβ1-42寡聚体 SDS-PAGE 凝胶电泳-考马斯亮蓝ophoresis-coomassie brilliant blue staining ofAβ胞模型寡聚体作用于 hBMEC 细胞 24 h，经 MTT 法度条件下的 Aβ1-42寡聚体能显著性降低 hBME相关性，即 Aβ1-42寡聚体浓度越高，作用细胞文献调研，为使细胞能保持一定活性，选择模型细胞，进行后续实验。

石杉碱甲,丹参提取物,细胞活性,细胞的

经 MTT 法测得的细胞活性如图2-3.A 所示，6.25-200μg/mL 丹参提取物能提高细胞的活性，并呈现出浓度正相关性，即丹参提取物浓度越高，作用细胞后其活性比正常培养下细胞的活性更高。但是当丹参提取物浓度大于 200μg/mL，表现出细胞毒性，降低细胞的活性。因此，选择对细胞活性没有抑制作用的丹参提取物（50、100、200 μg/mL）进行后续实验。2、阳性药石杉碱甲对 hBMEC 细胞的毒性不同浓度石杉碱甲作用于 hBMEC 细胞 24 h，经 MTT 法测得的细胞活性如图 2-3. B 所示，浓度为 1.562-25 μM 的石杉碱甲能提高细胞的活性，50 μM 石杉碱甲作用于细胞 24h 后的细胞活性与对照组细胞活性基本相同。但是当石杉碱甲浓度大于 100μM，表现出细胞毒性，降低细胞的活性。因此，选择对细胞活性没有抑制作用的石杉碱甲三个较高浓度（12.5、25、50 μM）进行后续实验。图 2-3. 不同浓度丹参和石杉碱甲对 hBMEC

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