p53-p21信号通路在心肌肥大中的作用及雷公藤甲素对其影响

发布时间：2020-08-18 16:32

【摘要】：心肌肥大(cardiac hypertrophy)是众多心血管疾病的一个共同特征,高血压、心瓣膜病和冠心病等多种疾病的发展过程中常常伴有心肌肥大。尽管它有助于代偿性保持心功能,但长期的心肌肥大最终会导致心衰。心肌细胞作为一种终末分化细胞,出生后不久就不再具有分裂能力。当心脏受到损伤性刺激时,细胞内核酸和蛋白合成增加但不能完成分裂,最终导致细胞肥大。防治与逆转心肌肥大已成为心血管疾病治疗的主要目标。p53作为一种抑癌基因,是调节细胞周期、抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡的重要转录因子,正常情况下维持于较低水平,激活时能诱导其下游基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)p21的表达,调节细胞周期进程。雷公藤甲素(triptolide,TP)是从雷公藤中提取出的一种环氧二萜类内酯型化合物,具有多种生物学活性,常用于治疗炎症和自身性免疫疾病,如风湿性关节炎、慢性肾炎和哮喘等。雷公藤甲素能否通过影响p53-p21信号通路从而抑制心肌细胞肥大尚不明确。本研究旨在探讨p53-p21信号通路在心肌肥大中的作用机制,及雷公藤甲素对心肌细胞p53-p21信号通路的影响。方法:1. 分离乳鼠心肌细胞,在不含血清的培养基里恒温孵育24h,待细胞贴壁后进行干预,按MOI=10感染p21或p53腺病毒12h,或者加入p21/p53 si RNA孵育5-7h后,更换为新鲜的低糖DMEM恢复24h。加入Ang II 1μmol/L与TP 1、3、10μg/L,处理24小时。荧光标记鬼笔环肽染色,荧光显微镜下观察细胞形态,测定细胞面积。分别采用Real-time PCR和Western blot检测p21、p53和β-MHC m RNA及蛋白表达变化情况。免疫荧光染色α-actinin和p21,激光共聚焦显微镜观察p21细胞内表达情况。2.健康SPF级雄性C57小鼠,随机分为对照组、模型组、雷公藤甲素(0.3、1、3或10μg·kg~(-1)·d~(-1))处理组,共6组,每组5只。分别给予生理盐水、异丙肾上腺素渗透压微量泵灌注(40 mg·kg~(-1)·d~(-1),sc,14d)和异丙肾上腺素灌注+TP(0.3、1、3或10μg·kg~-~1·d~(-1),ip,qd)。另一批小鼠随机分为对照组、模型组、p53腺病毒组、p53抑制剂组、雷公藤甲素组(10μg·kg~(-1)·d~(-1))、p53腺病毒+TP组和p53抑制剂+TP组,模型组处理同前,p53腺病毒组尾静脉注射2×10~(7 )TU的p53腺病毒,p53抑制剂组注射pifithrin-α(2mg·kg~(-1)·d~(-1),ip,qd)。3.实验过程中,密切观察小鼠一般状况及死亡情况。末次给药后,称量体重,测定小鼠心脏指数。采用麦胚凝集素染色观察计算细胞平均面积,HE和Masson染色观察心肌组织病理变化与胶原沉积情况。4.分别采用Real-time PCR和Western blot法检测心肌组织中p21、p53、β-MHC和PCNA m RNA及蛋白表达变化。结果:1. Ang II处理后心肌细胞面积明显增加,β-MHC、p53、p21 m RNA和蛋白表达量均显著升高;1~10μg/L的TP能剂量依赖性降低细胞面积以及上述基因的表达。2. p21或p53腺病毒转染均能诱导心肌细胞面积明显增加,并进一步加剧Ang II所引起的细胞肥大及β-MHC、p53、p21 m RNA与蛋白表达上升;而p21和p53 si RNA可以部分削弱Ang II引起的以上变化。3.正常情况下p21于细胞浆内低表达,Ang II和p53-Ad能上调p21的表达并且使p21向细胞核转移,而p53 si RNA则下调p21的表达。4.TP能有效抑制Ang II引起的细胞面积增加及β-MHC、p53、p21 m RNA与蛋白表达上升,p21和p53腺病毒会部分削弱TP对细胞肥大的抑制作用,而p21和p53si RNA对TP起到协同作用。5.ISO处理模型组小鼠心脏指数明显要高于对照组,纤维间质和血管周围出现胶原沉积,心肌纤维断裂,心肌细胞面积明显增大,β-MHC、p53、p21和PCNA m RNA和蛋白表达增加;而在给予了0.3~10μg·kg~(-1)·d~(-1)的TP后,心脏指数较ISO组呈不同程度的降低,心肌细胞面积减小,纤维化得到有效抑制;高剂量组β-MHC、p21和PCNA m RNA显著降低,1~10μg·kg~(-1)·d~(-1)的TP能显著抑制β-MHC、p53、p21和PCNA蛋白表达。6.p53腺病毒转染会引起小鼠心脏指数升高,心肌细胞面积同对照组相比显著增加;同时,p53腺病毒处理明显降低TP抑制纤维化和下调p53 m RNA和蛋白的作用。结论:1.体外培养心肌细胞以及小鼠心肌肥大过程中均伴随着p53、p21的表达上升。2. 雷公藤甲素能下调心肌细胞p53和p21的表达,显著抑制Ang II所导致的原代心肌细胞肥大反应和ISO处理诱导的小鼠心肌肥大。3.0.3~10μg/kg的雷公藤甲素能呈剂量依赖性减轻心肌损伤,抑制心肌纤维化。4.p53的表达升高会引起p21的升高和PCNA的下调,同时p21对p53的表达具有有限的正反馈调节作用。5.TP对心肌肥大的抑制作用可能和降低p53-p21信号通路的活性,减少细胞内蛋白质合成有关。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

(9)结果分析显影后，使用 Image Lab 软件进行积分析。2.1.5.6 统计学处理所有数据以平均数±标准差( x±s)表示，采用 SPSS 19.0 软件进行单因素方以 p<0.05 认为具有显著性差异。 结 果2.2.1 雷公藤甲素对原代心肌细胞肥大反应的影响2.2.1.1 雷公藤甲素对 AngII 处理后的原代心肌细胞面积的影响经 AngII 刺激 24h 后原代心肌细胞面积明显增加，与对照组相比，其平均面 115% (p<0.01)。而在加入了 1、3、10 μg/L 的 TP 后，与模型组相比，细胞均显著减小(p<0.01) (见图 1~2)。

图 2. 雷公藤甲素对 Ang II 处理后的原代心肌细胞面积的影响(n=50， x±s)与对照组比较，**p<0.01；与 Ang II 处理组相比，##p<0.01.2.1.2 雷公藤甲素对 AngII 处理后的原代心肌细胞 β-MHC、p53、p21 m达的影响eal-time PCR 反应后经内参 β-actin 与对照组 mRNA 校正，模型组中 β21 mRNA 表达均明显上升(p<0.01)，高、中、低剂量 TP 组的 β-MHC、p 的表达较模型组都呈显著下降(p<0.01) (见图 3)。estern blot 法检测原代心肌细胞中 β-MHC、p53、p21 的蛋白质的表达，-actin 相比校正后，模型组中的 β-MHC、p53、p21 的蛋白表达较对照组6%、55%、52%(p<0.01)。在高、中、低 TP 剂量组 β-MHC、p53、p21 的不同程度的降低，与 AngII 处理组相比，3.0，10.0 μg/LTP 组 β-MHC 表了 36%和 43%(p<0.01)，10.0 μg/LTP 组 p53 表达量降低了 59% (p<0.01

图 3. 雷公藤甲素对 AngII 处理后的原代心肌细胞 β-MHC、p53、p21 mRNA 表达的影响 (n=4， x±s)与对照组比较，**p<0.01；与 AngII 处理组相比，##p<0.01图 4. 雷公藤甲素对 AngII 处理后的原代心肌细胞 β-MHC、p53 和 p21 蛋白表达的影响

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 方勇;蓝文贤;孔令义;;p53蛋白的结构生物学研究进展[J];生命的化学;2015年04期

本文编号：2796465