向日葵茎芯多糖的提取纯化与活性评价

发布时间：2020-08-21 19:04

【摘要】：向日葵(Helianthus annuus L.)别名葵花,据文献记载向日葵的茎、叶、籽、盘、根均有较高的药用价值。特别是,向日葵茎芯的水提液在临床上有抗肿瘤的作用。在寻找向日葵茎芯中具有抗肿瘤活性的物质过程中,多糖被筛选了出来。本文首次对其抗肿瘤转移作用机制进行了研究,并对其结构进行了初步解析。主要研究结果如下:1.采用水提醇沉法对向日葵茎芯多糖进行了提取,利用单因素实验得到最佳提取条件为:浸提次数为2次,原料颗粒的大小(目数)为60~80目,料液比为1:50,浸提时间为3.0 h,浸提温度为90 ~oC,在该条件下,向日葵茎芯多糖的提取得率为6.56%,多糖的含量为266.03 mg/g。2.提取所得粗多糖利用Sevag法除去蛋白、活性炭法除去色素后,利用DEAE纤维素DE-52离子交换柱层析法进行分离纯化,得到四个多糖组分分别为HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4,其得率分别为3.03%、4.19%、1.82%和0.96%。经紫外光谱全波长扫描分析显示HALWP-1、HALWP-2和HALWP-3几乎不含有核酸和蛋白质,HALWP-4可能含有少量蛋白或有蛋白结构,可能为糖蛋白或氨基糖。经红外光谱检测显示这四种组分均有多糖的特征性基团,推测有O-H、C-H、C=O、C-O和糖醛酸,推测这四种多糖组分可能为β-构型的吡喃糖。经高效凝胶排阻色谱检测,HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4的平均分子量分别为3.82×10~5,2.98×10~5,3.36×10~5,4.72×10~5 Da。3.采用MTT法研究向日葵茎芯多糖的体外抗肿瘤活性:向日葵茎芯多糖对人类胃癌细胞SGC-7901的IC_(50)值为4.201±0.083 mg/mL;对人类结肠癌细胞HCT-8的IC_(50)值为5.843±0.069 mg/m L;对人类口腔上皮癌细胞KB的IC_(50)值为3.016±0.078 mg/mL,这些数据表明向日葵茎芯多糖体外抗肿瘤活性较弱,不足以解释其临床上较强的抗肿瘤活性。4.采用昆明小鼠建立S180原位肿瘤模型对向日葵茎芯多糖的体内抗原位肿瘤活性进行研究,研究结果表明空白组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺:25 mg/kg)和多糖给药组(向日葵茎芯多糖:250 mg/kg)小鼠的平均体重分别为36.17±1.26 g、33.42±1.33 g和35.06±1.19 g;阳性对照组的抑瘤率为63.73%,多糖给药组的抑瘤率为51.16%;三组的平均生存时间分别为49.58 d、54.0 d和57.83 d,表明向日葵茎芯多糖的毒副作用较小,能够明显延长小鼠的生存时间,具有较强的抗S180肿瘤的活性。5.采用C57BL/6小鼠建立Lewis肺癌肿瘤转移模型,对向日葵茎芯多糖及其不同组分的体内抗肿瘤转移活性进行研究。研究结果表明,空白组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺:25 mg/kg)、向日葵茎芯多糖及其各组分(HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3、HALWP-4)给药组(给药剂量均为250 mg/kg)小鼠的平均体重依次为22.57±1.08 g、20.94±1.22 g、21.32±1.36 g、21.78±2.02 g、21.12±1.85 g、21.67±0.98 g、22.23±1.34 g;抑瘤率分别为61.32%、52.17%、48.45%、45.12%、56.86%、58.61%;各组平均生存时间分别为38.7 d、40.8 d、47.3 d、43.1 d、46.2 d、47.7 d、50.5d,表明向日葵茎芯多糖及其各组分的抗肿瘤效果与临床药物环磷酰胺较为相似,且毒副作用较小,能够明显延长C57BL/6小鼠的生存时间,具有较强的抗Lewis肺癌肿瘤转移的活性。6.采用C57BL/6小鼠建立Lewis肺癌肿瘤转移模型,对向日葵茎芯多糖及其组分的免疫增强活性进行研究。研究结果表明,空白组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺组:25 mg/kg)、向日葵茎芯多糖及其各组分(HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3、HALWP-4)给药组(给药剂量均为250 mg/kg)小鼠的脾指数分别为6.53±0.52 mg/g、6.07±0.49 mg/g、7.08±0.38 mg/g、6.91±0.56 mg/g、7.04±0.67 mg/g、7.13±0.52mg/g、7.33±0.43 mg/g;胸腺指数分别为1.28±0.33 mg/g、1.19±0.29 mg/g、1.42±0.42 mg/g、1.39±0.37 mg/g、1.35±0.42 mg/g、1.46±0.38 mg/g、1.52±0.42 mg/g。以上数据表明向日葵茎芯多糖及其不同组分能够刺激宿主免疫系统,通过促进脾和胸腺细胞的增殖来提高宿主免疫功能,进而达到抗肿瘤的作用。7.采用ELISA试剂盒检测向日葵茎芯多糖及其不同组分对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)的量的影响。研究结果显示空白组、向日葵茎芯多糖及其不同组分(HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3、HALWP-4)给药组(50μg/m L)处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α的量依次为179.26±10.52 pg/mL、166.70±9.78pg/m L、170.79±10.36 pg/mL、175.06±10.56 pg/mL、173.51±9.33 pg/mL、168.24±9.82 pg/mL;体内实验表明Lewis肺癌荷瘤C57BL/6小鼠血清中TNF-α的量依次为163.23±8.26 pg/m L、149.53±9.12 pg/m L、143.18±8.52 pg/mL、148.08±9.23 pg/m L、155.94±8.97 pg/mL、148.25±7.98 pg/mL。以上研究结果表明向日葵茎芯多糖及其不同组分均能不同程度抑制巨噬细胞释放TNF-α。其抗肿瘤转移机制可能是向日葵茎芯多糖及其不同组分能够与肿瘤细胞释放的多功能糖蛋白竞争和巨噬细胞的TLR2受体结合,从而干扰了巨噬细胞释放TNF-α,进而抑制了肿瘤细胞的转移。以上研究结果为向日葵茎芯开发为低毒的抗肿瘤药物奠定了基础。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284.2
【图文】：

图 2-1 多糖标准曲线Figure 2-1 Standard curve of polysaccharide提取条件的单因素实验结果茎芯多糖含量的影响

图 2-2 浸提次数对向日葵茎芯多糖含量的影响igure 2-2 Effect of number of times on Polysaccharide extraction ra大小（目数）对向日葵茎芯多糖含量的影响 2-3。由图 2-3 可知，随着目数的增加，向日葵茎芯多

图 2-3 原料颗粒的大小对向日葵茎芯多糖含量的影响Figure 2-3 Effect of mesh number on Polysaccharide extraction rate日葵茎芯多含量的影响 2-4。由图 2-4 可知，当料液比低于 1:50 时，多糖的含

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本文编号：2799747