红景天苷类似物对脑缺血损伤的保护及机制研究

发布时间：2020-08-23 13:32

【摘要】：目的:研究表明传统藏药红景天苷分子极性较大而脂溶性较小,难以透过血脑屏障。为此,我们通过结构改造合成了红景天苷类似物(SalA-4g)。本文分析SalA-4g在大鼠各脏器中的分布以及药代动力学；探讨SalA-4g对氧糖剥夺(OGD)损伤海马神经元以及大脑中动脉栓塞(MCAO)模型鼠的脑保护作用及相关机制。通过研究为将其开发为一种神经保护剂应用于临床防治缺血性脑血管病提供重要的理论基础。方法:1.采用高效液相色谱(HPLC),大鼠单剂量静脉注射SalA-4g,于不同时间点采集血浆和器官样品,检测其中SalA-4g的浓度。采用DAS软件对血药浓度-时间曲线进行统计矩拟合,得出系列药代动力学参数,分析SalA-4g在大鼠体内代谢过程动态规律以及各脏器中的分布。2.采用线栓法建立大鼠MCAO损伤模型,通过mNSS神经功能评分、脑梗死体积测定和TUNEL,分析SalA-4g对MCAO模型鼠脑损伤的保护作用;通过18-氟化脱氧葡萄糖正电子发射扫描(18FDG-PET/CT)检查,观察SalA-4g对MCAO鼠缺血脑组织葡萄糖摄取能力的影响;采用Western blot,观察SalA-4g对MCAO鼠缺血脑组织葡萄糖转运蛋白GLUT3表达的影响。3.体外培养胚胎17-18 dSD大鼠海马神经元,建立神经元OGD损伤模型,采用MTT和Hoechst染色,观察SalA-4g对OGD损伤海马神经元的保护作用;采用荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)、免疫细胞化学染色,观察SalA-4g对OGD损伤海马神经元葡萄糖摄取和神经元GLUT3表达的影响,探讨PKA/CREB/GLUT3通路是否参与SalA-4g增强OGD损伤海马神经元的葡萄糖摄取以及神经保护作用。结果:1.SalA-4g检测浓度的线性范围为0.1～200 μg/ml(r2=0.9996),最低检测限为0.1 μg/ml;药动学参数:SalA的T1/2(h)为 0.657,V(L/kg)为 7.376;SalA-4g 在体内主要通过肝代谢、肾排泄,在肺、心、脾和脑中分布相对较少,但清除较慢。2.Sa1A-4g对OGD损伤的海马神经元具有显著保护作用,能抑制细胞活力的下降和减少细胞凋亡的发生,并呈现剂量依赖效应,在浓度为200 μM时作用最佳,且保护效果优于同等剂量的红景天苷。3.Sa1A-4g对MCAO模型鼠具有显著的脑保护作用,可以降低mNSS行为学评分,减轻脑梗死体积,降低模型鼠大脑皮层和海马CA1区域的细胞凋亡率,且呈现剂量依赖效应,50 mg/kg Sa1A-4g的脑保护作用最佳,并且优于同等剂量的红景天苷。4.Sa1A-4g能显著提高OGD损伤海马神经元的葡萄糖摄取能力,增强神经元GLUT3的表达,并且这种变化呈剂量依赖性,浓度为200 μM作用最显著,而红景天苷对GLUT3表达的影响不大。5.Sa1A-4g能显著提高MCAO模型鼠脑葡萄糖代谢水平,改善脑梗死区代谢恢复率,增强模型鼠皮层区和海马区组织GLUT3的表达,在所观察的剂量范围内呈现剂量依赖效应,50mg/kg Sa1A-4g作用最佳,而红景天苷对缺血脑组织GLUT3表达无明显影响。6.Sa1A-4 g能够激活OGD损伤后的海马神经元CREB以及调节PKARⅡ的表达;采用H-89抑制PKA/CREB信号通路后,明显拮抗了Sa1A-4g诱导的OGD损伤海马神经元GLUT3表达增强、葡萄糖摄取的增强以及神经保护作用。结论:1.红景天苷类似物Sa1A-4g经结构修饰改造后疏水性增加、亲油性增高,与红景天苷相比更易透过血脑屏障进入中枢而发挥脑保护作用。2.Sa1A-4g对大鼠海马神经元OGD损伤以及MCAO模型鼠脑缺血损伤具有显著保护作用。3.Sa1A-4g的神经保护作用与增强缺血脑组织的葡萄糖摄取能力相关,PKA/CREB/GLUT3信号通路能通过增强葡萄糖摄取来参与Sa1A-4g的脑保护作用。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

图３．邋ＳａｌＡ－４ｇ的色谱图逡逑Ａ：空白血浆逡逑Ｂ：空白血i}＋ＳａｌＡ－４ｇ邋（１００邋｜ｊｇ／ｍｌ）逡逑Ｃ：给药５邋ｍｉｎ后的血i}＃品逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ＳａｌＡ－４ｇ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ逡逑Ａ：邋Ｂｌａｎｋ邋ｒａｔ邋ｐｌａｓｍａ逡逑Ｂ：邋Ｂｌａｎｋ邋ｒａｔ邋ｐｌａｓｍａ邋ｓｐｉｋｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＳａｌＡ－４ｇ邋（１００邋｜ｘｇ／ｍｌ）逡逑Ｃ：邋Ｒａｔ邋ｐｌａｓｍａ邋ｓａｍｐｌｅ邋５邋ｍｉｎ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋ＳａｌＡ－４ｇ邋（５０邋ｍｇ／ｋｇ）逡逑（三）精密度测定逡逑取空白血浆加入ＳａｌＡ－４ｇ标准品，分别配制低、中、高（１，１０，邋１０0Ｈｇ／ｍｌ）３浓度的ＳａｌＡ－４ｇ血浆样品，按“２．邋２”生物样品预处理方法处理，平行做５份，连续５逡逑

２．邋ＳａｌＡ－４ｇ对正常培养海马神经元活力的影响逡逑采用ＭＴＴ法观察ＳａｌＡ－４ｇ对正常培养以及ＯＧＤ损伤海马神经元活力的影响。给逡逑予不同浓度ＳａｌＡ－４ｇ邋（８ｐＭ，４０＾ｉＭ，２００邋ｐＭ）处理海马神经元２４ｈ，邋ＭＴＴ检测细逡逑胞活力结果发现，不同浓度的ＳａｌＡ－４ｇ对正常海马神经元活力无明显影响（图７）。逡逑２４逡逑

胞活力轻微增高，但是随着ＯＧＤ损伤时间的延长，海马神经元活力逐渐下降，ＯＧＤ逡逑损伤６邋ｈ复氧复糖２４邋ｈ时，细胞活力下降为正常对照组的６５％左右，该损伤条件用于逡逑后续实验的进行（图８）。逡逑海马神经元采用ＯＧＤ处理６邋ｈ，复氧复糖２４邋ｈ，在复氧复糖的同时给予不同浓逡逑度ＳａｌＡ－４ｇ邋（８ｐＭ，４０ｐＭ，邋２００邋ＭＭ）孵育２４ｈ，检测细胞活力。结果表明，ＯＧＤ逡逑损伤后海马神经元活力明显下降，ＳａｌＡ￣４ｇ处理可有效拮抗ＯＧＤ损伤所引起的海马逡逑神经元活力的下降，在所观察剂量范围内呈现剂量相关性，２００邋保护作用最明显，逡逑且优于２００邋ｐＭ红景天苷（Ｓａｌ），见图９。逡逑倒置相差显微镜下观察发现，正常对照组的海马神经元胞体透亮，细胞突起完整，逡逑相互交织成网；ＯＧＤ损伤组细胞胞体明显皱缩，折光性下降，突起回缩或断裂，部逡逑分细胞成团；给予不同浓度ＳａＩＡ－４ｇ处理后可显著恢复神经元形态

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