离体脑神经血管单元模型的建立及β-石竹烯对其缺氧复氧损伤的保护作用研究

发布时间：2020-08-23 17:36

【摘要】：目的:采用大鼠原代脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)、星形胶质细胞、神经元细胞建立离体脑“神经血管单元(neurovascular unit,NVU)”共培养模型,并观察β-石竹烯(β-Caryophyllene,BCP)对其缺氧复氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation,OGD/R)损伤的保护作用。方法:1.(1)大鼠BMECs、星形胶质细胞、神经元细胞的培养方法分别如下:1)分离2周龄SD乳鼠的脑皮层组织,加入Ⅱ-型胶原酶和胶原酶/分散酶消化脑组织,20%BSA分离微血管段,消化传代纯化细胞,免疫荧光法(Immunofluorescence technique,IF)检测内皮细胞特异性蛋白Ⅷ因子(FactorⅧ)进行鉴定细胞纯度。2)分离24 h内新生SD乳鼠的皮层组织,加入0.125%的胰酶消化,用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM-F12培养基培养,通过振摇法纯化细胞,IF检测星形胶质细胞特异性酸性胶质纤维蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定细胞纯度。3)分离胚胎期17-19 d的SD乳鼠的脑皮层组织,先用含10%FBS的DMEM培养基培养细胞4-6 h,再改用Neurobasal+B27培养基培养,IF检测神经元特异性微管相关蛋白(microtubuleassociatedprotein,map-2)鉴定细胞纯度。(2)共培养模型的构建:采用transwell细胞小室共培养细胞。神经元于孔板底部生长至第5d后直接用于建模,transwell膜的外侧接种传代纯化后的星形胶质细胞,依靠张力作用5h后将其放入接种有神经元的孔板中,24h后于transwell膜的内池接种传代纯化后的bmecs,共培养3d后用于后续实验。并通过以下指标鉴定nvu模型:4h渗漏实验和跨内皮细胞电阻值(transendothelialelectricalresistance,teer)初步鉴定模型。相差显微镜和扫描电镜观察共培养模型中细胞的生长状态、透射电镜观察内皮细胞间的紧密连接(tightjunction,tj)、伊文思蓝(evansblue,eb)检测模型的通透性。2.构建离体nvu缺氧复氧损伤模型,分为正常对照组(controlgroup),缺氧复氧损伤组(ogd/rgroup),β-石竹烯组(bcp+ogd/rgroup,10μmol/l)。并通过以下指标观察β-石竹烯的保护作用:检测teer以及eb渗透率反应nvu通透性的变化、明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-9(metalloproteinase-9,mmp-9)的活性,westernblot检测tj蛋白、凋亡相关蛋白以及生长相关蛋白-43(growth-associatedprotein-43,gap-43)表达、流式细胞仪检测神经元凋亡情况、免疫酶联法(elisa)检测nfg-β,sod、mda、ldh、no、tnf-α、il-1β、il-6的表达。结果:1.成功培养3种原代细胞。(1)bmecs呈典型的涡旋状生长,特异性factor-Ⅷ鉴定纯度可达96%以上。(2)星形胶质细胞经振摇传代处理后GFAP鉴定纯度达97%以上。(3)神经元细胞MAP-2鉴定纯度可达90%以上。(4)三细胞共培养中细胞生长状态良好,并有相互促进生长的作用。4h渗漏试验中各孔液面均无明显下降,TEER值显著高于双细胞和单细胞培养,EB渗透率明显低于双细胞和单细胞培养,3细胞共培养模型中内皮细胞之间形成了具有屏障功能的TJ结构和桥粒结构。2.BCP对缺氧复氧诱导的离体NVU模型损伤具有保护作用:BCP可显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6,MDA、LDH、MMP-9以及促凋亡蛋白Bax的表达量(P0.05),上调紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1、GAP-43、NFG-β、SOD以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达量(P0.05)。结论:1.三细胞共培养模型中细胞之间可相互促进生长,能更好地模拟在体复杂的生理环境,与在体NVU具有部分相似的生理功能。2.β-石竹烯对缺氧复氧损伤的离体NVU模型具有显著的保护作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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