商陆醋制法炮制减毒存效机制研究

发布时间：2020-08-23 19:52

【摘要】：商陆为商陆科植物商陆Phytolacca acinosa Roxb.或垂序商陆Phytolacca americana L.的干燥根,属峻下逐水药,具有逐水消肿,通利二便等功效,临床主要用于治疗肾性水肿、肝硬化腹水等疾病。但其生品有毒,使用不当可导致恶心呕吐、腹痛腹泻等症状,严重者可引起呕血、便血、昏迷、心脏及呼吸系统麻痹致死,故临床应用须炮制以降低毒性。2015版《中国药典》收录商陆炮制方法为醋炙法,醋炙的目的是能降低毒性缓和药性。课题组前期研究发现商陆主要毒性部位为正丁醇部位,主要毒性成分为商陆皂苷丙(EsC)和商陆皂苷乙(EsB)等成分,醋制法炮制可降低正丁醇部位毒性和毒性皂苷的含量。有报告认为商陆皂苷甲(EsA)是商陆的主要药效成分,具有利尿、抗炎的作用,说明商陆中的皂苷类成分与其毒性和药效相关,而因皂苷类成分结构的差异,所表现出的毒性及药效存在差异,有的皂苷具有毒性,有的皂苷具有效应。现有文献对商陆醋制后的利尿作用评价不一,醋制后商陆减毒存效的机制还不明确。本论文以商陆生品及醋制品为研究对象,分离纯化商陆主要的皂苷类成分,在整体动物和细胞分子水平评价商陆醋制前后药效、毒性变化,不同皂苷类成分药效与毒性差异,分析商陆醋制前后组成变化与商陆药效和毒性变化的相关性,初步阐明商陆醋制减毒存效的炮制机理。主要实验内容和结果总结如下:1.醋制前后商陆水提液药效和毒性变化研究建立盐水负荷大鼠肾脏利尿药效和肠道毒性模型,以大鼠尿量、尿电解质含量、ELISA法测定血浆抗利尿激素(ADH)、醛固酮(ALD)和心房钠尿肽(ANP)三种激素含量以及Western Blot法测定肾脏水通道蛋白(AQPs)和钠通道蛋白(NHE3、ATP、NCC)表达水平为指标,评价商陆利尿药效及作用机制;同时以盐水负荷模型大鼠给药后各肠段的肠道含水量和qPCR法测定炎症因子TNF-α、IL-1β mRNA表达水平为指标,评价商陆肠道毒性。利尿作用研究结果显示,与模型组相比,商陆醋制前后均能显著增加盐水负荷模型大鼠尿量和尿电解质含量,降低血浆ADH含量,抑制肾脏AQP1、AQP2、AQP3及NHE3、ATP蛋白表达;生品同时能显著抑制肾脏AQP4及NCC蛋白表达,醋制品能显著降低血浆ALD含量、升高ANP含量;而与生品组相比,醋制品能显著增加尿量以及尿钾、尿钠、血浆ANP含量,显著抑制肾脏AQP3及NHE3和ATP蛋白表达。肠道毒性研究结果显示,与模型组相比,商陆生品显著提高大鼠空肠、回肠含水量及TNF-αα和IL-1β mRNA表达水平,醋制商陆组各肠段含水量无显著差异;与生品组比较,商陆醋制品组空肠和回肠TNF-α和IL-1β mRNA表达水平显著降低。上述实验结果表明商陆醋制前后均有较强的利尿作用,但生品可导致肠道水肿、炎症,经醋制法炮制后肠道水肿、炎症减轻,同时可保存其利尿作用,达到减毒存效的炮制目的。2.商陆利尿药效部位和炎症毒性部位筛选及成分分离纯化研究在整体动物药效实验结果基础上,建立小鼠肾脏内髓集合管3上皮细胞(mIMCD3)体外培养药效评价模型,以Western Blot法测定mIMCD3细胞AQP2和AQP3蛋白表达为利尿药效评价指标;建立小鼠巨噬细胞(RAW264.7)体外培养毒性评价模型,以ELISA法测定巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1ββ释放水平为致炎毒性评价指标,筛选商陆药效部位及毒性部位。将商陆水提物进一步萃取分离得商陆乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位,在体外培养的mIMCD3和RAW264.7细胞体系中分别给予上述三种萃取部位,检测mIMCD3细胞中AQP2、AQP3蛋白表达水平和RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β释放水平。结果显示商陆正丁醇部位抑制mIMCD3细胞AQP2和AQP3蛋白表达的作用最强,同时相较于其他提取部位,正丁醇部位显著增加巨噬细胞释放TNF-α和IL-1β水平,表明商陆正丁醇部位既是商陆利尿作用的主要部位也是其炎症毒性的主要部位。进一步采用硅胶柱层析、中压制备C18柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析多种分离纯化方法分离正丁醇部位中的化合物。结果共分离纯化获得3个正丁醇部位中主要的单体化合物,运用核磁共振技术鉴定解析其结构分别为商陆皂苷甲(EsA)、商陆皂苷乙(EsB)和商陆皂苷辛(EsH)。3.商陆皂苷类成分利尿作用及炎症毒性研究采用前述建立的体外药效及毒性评价模型,以Western Blot法测定肾脏内髓集合管3上皮细胞(mIMCD3)中AQP2、AQP3蛋白表达水平和ELISA法测定巨噬细胞(RAW264.7)TNF-α和IL-1β释放水平为指标,比较商陆皂苷类成分EsA、EsB和EsH的利尿药效和炎症毒性。实验结果表明,EsA能显著抑制mIMCD3细胞中AQP2蛋白表达,EsB和EsH则显著升高AQP2蛋白表达,三者均能显著抑制AQP3蛋白表达。因AQP2在水液重吸收作用方面较AQP3为优势蛋白,表明EsA是商陆利尿药效的主要成分;EsA能同时显著抑制RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β释放水平,表明其无致炎毒性,EsB、EsH显著促进TNF-α的释放,且EsH毒性强于EsB,表明EsH是商陆产生炎症毒性的主要成分。含量测定表明EsA和EsH两者在商陆正丁醇部位中的含量最高,综合药效和毒性的实验结果,说明商陆的正丁醇部位中主要利尿药效成分是EsA,主要炎症毒性成分是EsH。4.醋制对商陆皂苷类成分影响研究以商陆主要利尿药效成分EsA和主要炎症毒性成分EsH为研究对象,将其进行模拟醋制,HPLC-ELSD法定性分析EsA和EsH模拟醋制后成分变化。实验结果表明,EsA和EsH在与水加热的条件下未显示生成新成分;EsA在醋制过程中部分分解生成新化合物;而EsH在醋制过程中化学结构发生变化,可转化生成EsA以及与EsA醋制过程中生成的相同新化合物。通过对EsA和EsH结构对比,发现两者结构差异在于EsH C-28位的酯键比EsA多连接一分子葡萄糖,结合两者模拟醋制变化的测定结果,推测EsH可在醋制的酸性条件下发生酯键水解反应,脱去一分子葡萄糖,转化生成EsA。两种皂苷类成分在商陆正丁醇部位模拟醋制及商陆饮片醋制前后含量测定结果显示,商陆正丁醇部位中EsH和EsA含量分别为0.29%和1.04%,模拟醋制后EsH含量显著下降96.91%,EsA含量下降63.35%;商陆生品EsH和EsA含量分别为0.27%和0.60%,醋制后EsH含量显著下降45.88%,而EsA含量基本不变,仅下降2.51%,说明确实在醋制过程中毒性成分EsH发生了结构变化,导致含量显著下降,而EsA含量基本不变化,其中一部分来源于EsH的转化。结合前述对醋制前后商陆皂苷类成分变化及药效、毒性变化的实验结果,揭示商陆醋制减毒存效的初步机制是:在醋制炮制过程中,商陆中主要引起炎症毒性的皂苷类成分EsH可在酸性条件下发生酯键水解反应,转化生成具有较强利尿活性的EsA,从而达到减毒存效的炮制目的。综上所述,本文通过整体动物实验明确醋制可显著降低商陆肠道毒性,同时保存了显著的利尿作用,并且商陆的主要利尿药效部位及致炎毒性部位均为正丁醇部位。从正丁醇部位分离并鉴定出3个三萜皂苷类化合物EsA、EsB、EsH;EsA能显著抑制肾脏细胞AQP2和AQP3蛋白表达,EsH能显著促进巨噬细胞释放炎症因子TNF-α,结合课题组前期对商陆皂苷EsC和EsB肠道毒性研究基础,确定EsA为商陆主要利尿药效成分,EsH为主要炎症毒性成分之一;通过对两者模拟醋制和结构比较,发现醋制可以使EsH的酯键水解,进而转化生成EsA。商陆饮片醋制后EsH含量显著降低,EsA含量基本不变。说明醋制可使商陆主要的炎症毒性成分转化生成主要的利尿药效成分,从而达到减毒存效的炮制目的。本文结果证实了商陆传统采用醋制法炮制合理性和科学性,初步阐明了商陆醋制法炮制减毒存效的炮制机理,为饮片生产、质量控制及临床应用提供依据。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

注：与模型组比较，＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１；与商陆生、醋品对应低剂量组比较，＃Ｐ＜０．０５，邋＃＃户＜０．０１；逡逑与商陆生品对应剂量组比较，Ａ尸＜０．０５。逡逑图３－２商陆醋制前后对盐水负荷模型大鼠尿电解质的影响（ｘ＿±ｈ邋？＝８）逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｖｉｎｅｇａｒ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｏｎ邋ｕｒｉｎａｒｙ邋ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ邋ｉｎ逡逑ｓａｌｉｎｅ－ｌｏａｄｅｄ邋ｒａｔｓ邋（邋ｘ邋±邋■？，ｎ＝８）逡逑３．３商陆醋制前后对盐水负荷模型大鼠血浆激素水平的影响逡逑与模型组比较，商陆生品仅高剂量组能显著降低血浆ＡＤＨ含量（Ｐ＜０．０１），对ＡＬＤ、逡逑ＡＮＰ含量分别有降低和增加的趋势，但无显著性差异（Ｐ＞0．0５）；醋制商陆高低剂量组均逡逑可显著降低血浆ＡＤＨ、ＡＬＤ含量（Ｐ＜０．０５￣０．０１），高剂量组能显著增加血浆ＡＮＰ含量逡逑（尸＜０．０５）；与商陆生品对应剂量组比较，醋制商陆的高剂量组能显著增加血浆ＡＮＰ含量逡逑（Ｐ＜０．０５）。表明商陆醋制后对大鼠血浆激素水平产生显著影响，其激素水平变化与其尿量逡逑变化一致，结果见表３－６和图３－３。逡逑表３－６商陆醋制前后对盐水负荷模型大鼠血浆ＡＤＨ、ＡＬＤ、ＡＮＰ的影响逡逑（ｘ士邋夕

（Ｐ＞０．０５）；与商陆生品对应剂量比较，醋制后各组空肠、回肠中ＴＮＦ－ａ和ＩＬ－ｉｐｍＲＮＡ逡逑表达显著降低（Ｐ＜０．０１）。表明商陆生品能够刺激大鼠空肠和回肠发生较强的肠道炎症，逡逑经醋制后肠道炎症显著降低，且趋向于正常表达水平，结果见表３－１１和图３－６。逡逑３１逡逑

时间对ＡＱＰ２蛋白表达无影响（Ｐ＞０．０５）；与给药２ｈ组比较，给药３、４、５、６ｈ均能显逡逑著降低ＡＱＰ３蛋白表达（Ｐ＜０．０１）。综合对ＡＱＰ２和ＡＱＰ３蛋白表达影响，选择４邋ｈ作为逡逑商陆药效部位筛选研究的给药时间，结果见表４－３和图４－２。逡逑表４－３商陆正丁醇部位不同给药时间对ｍＩＭＣＤ３细胞ＡＱＰ２和ＡＱＰ３蛋白表达的影响逡逑（ｘ士■？，逡逑Ｔａｂ．４－３邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｔｉｍｅ邋ｏｆ邋ｎ－ｂｕｔａｎｏｌ邋ｆｒａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ邋ｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＡＱＰ２邋ａｎｄ邋ＡＱＰ３邋ｉｎ邋ｍＩＭＣＤ３邋ｃｅｌｌｓ邋（邋；ｃ±邋？？，ｎ＝３）逡逑给药时间／ｈ逡逑组别邋逦逡逑逦０逦２逦３逦４逦５逦６逦逡逑ＡＱＰ２逦１．００±０．０３逦０．９６士０．０２逦０．６７±０．０３＊＊邋０．５９±０．０２＊＊＃＃邋０．６６±０．０３＊＊逦０．７０士邋０．０２＊＊逡逑ＡＱＰ３逦１．００±０．０２邋０．８３±０．０１＊＊邋０．６２±０．０１＊＊＾邋０．６０±０．０２＊＊＾邋０．６７±０．０２＊＊＾邋０．６５邋士邋０．０２＊＊＾逡逑注：与空白组比较

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