丹参茎叶改善糖尿病肾病的物质基础与作用机制研究

发布时间：2020-08-24 23:59

【摘要】：第一章 文献研究本章较为系统地对糖尿病及其慢性并发症的研究进展进行归纳总结,为深入认识糖尿病及其并发症的发病机制提供科学根据和理论指导。同时还总结了丹参及丹参茎叶中主要的活性成分,分析了近年来国内外在丹参及丹参茎叶治疗糖尿病及其慢性并发症所取得的研究进展,以期为丹参及丹参茎叶的综合开发与利用及其在临床上的合理用药提供科学根据和理论指导。第二章 丹参茎叶有效部位制备与化学成分分析本实验对丹参茎叶有效部位的提取纯化工艺进行了系统研究及综合评价。选取丹参茎叶中9种酚酸类成分、4种黄酮类成分的总含量及其浸膏得率为评价指标,通过单因素实验确定丹参茎叶提取方法及正交试验的因素水平,后采用正交试验考察提取溶剂、提取时间、料液比及提取次数对丹参茎叶提取工艺的影响,筛选其最佳提取工艺。采用大孔吸附树脂对丹参茎叶粗提物进行纯化,进一步考察树脂类型、上样液质量浓度、上样量、洗脱剂浓度及洗脱剂用量对指标成分纯化的影响,确定最佳大孔吸附树脂纯化工艺。并采用乙酸乙酯萃取法进一步提高指标成分的纯度。实验最终确定的最佳制备工艺为:以50%乙醇8倍量回流提取3次,每次提取1.0 h,合并多次提取液,浓缩后挥干溶剂即得丹参茎叶粗提物;以AB-8型大孔吸附树脂纯化,1.0 g/mL药液上样,上样量为每10 g干树脂上样5 g生药即1.5 g干燥提取物,40%乙醇洗脱,洗脱用量3 BV,可得丹参茎叶大孔树脂纯化物;采用乙酸乙酯萃取对其进一步纯化富集,萃取工艺为:萃取底物浓度0.1 g/mL、底物pH值为2、以2倍体积的乙酸乙酯萃取3次,合并多次乙酸乙酯部位萃取液,挥干溶剂后即得丹参茎叶总酚酸。该提取及纯化工艺稳定可行,纯化后丹参茎叶总酚酸纯度可达71.92%。第三章 丹参茎叶改善糖尿病肾病的多组分优化与作用机制研究一、基于HK-2、HBZY-1细胞模型筛选丹参茎叶多组分配伍比例本节实验以高糖及过氧化氢(H2O2)诱导大鼠肾小球系膜HBZY-1细胞及人肾小管上皮HK-2细胞损伤,建立体外肾组织细胞氧化应激模型,并从细胞增殖、细胞形态变化等方面研究丹参茎叶多组分对HK-2、HBZY-1细胞损伤的保护作用,筛选丹参茎叶中多种酚酸类成分的最佳配伍比例,为后续体内活性实验提供数据支撑。研究结果表明,丹参茎叶多组分中酚酸类成分(丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸)对HK-2及HBZY-1细胞的氧化损伤均有显著性的保护作用,丹参素未呈现出保护氧化损伤的活性;黄酮类成分中,芦丁对H2O2诱导HBZY-1损伤有一定的保护作用,异槲皮苷对H2O2诱导HK-2损伤有一定的保护作用,但对高糖模型均无回调趋势,紫云英苷未呈现出保护活性;丹参酮类成分也均未呈现出保护活性。后续单体配伍比例筛选实验中,选择5种单体成分即丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素、丹参酮IIA按照其在根中的比例(摩尔质量比1:0.07:0.04:0.07:0.05)、茎叶中的比例(摩尔质量比1:1.16:0.02:0.11:0.05)、自选比例(摩尔质量比1:1:1:1:1)进行组合,并考察加减丹参素、加减丹参酮IIA对单体配伍后活性的影响。实验结果发现,5种不同单体成分以不同比例配伍后对其细胞活性影响较大,其中5种单体成分按照根中存在的比例配伍(VG)、3种单体成分按照茎叶中存在比例配伍(TJ)、3种单体成分按照自选比例配伍(TZ)、4种单体成分按照茎叶中比例配伍(FJ)在HBZY-1、HK-2细胞的高糖及过氧化氢损伤模型中均显示出较好的活性,该结果可为后期体内药效活性筛选实验提供数据支撑。二、基于db/db小鼠模型的多组分改善糖尿病肾病的生物效应评价本节以db/db 2型自发性糖尿病肾病小鼠为实验动物模型,给予丹参茎叶多组分不同比例配伍后药物干预,对其肾脏病理切片及各项生化指标进行综合分析。实验结果表明,丹参茎叶多组分配伍后多组药物可对糖尿病肾病小鼠的病理状态有不同程度的改善作用,部分给药组可显著性回调其体内生化指标的病理性改变。综合各组生化指标改善情况及病理切片结果,同时参考前期细胞水平的活性筛选结果,初步确定5种单体成分最优配伍比例为:3种单体成分按照茎叶中存在比例配伍(TJ)、5种单体成分按照根中存在的比例配伍(VG)。两组配伍比例的高剂量组均能显著地改善糖尿病所引起的各项指标,调节其血糖水平、血脂水平及肾脏损伤,且其回调水平均优于其低剂量组。同时TJ、VG组可显著改善高糖及过氧化氢诱导的大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1及人肾小管上皮细胞HK-2损伤,表明其在体内、体外水平上均呈现良好的活性。三、丹参茎叶多组分对db/db小鼠肠道菌群多样性的调节作用研究本节实验通过16Sr DNA技术,分析db/db糖尿病肾病小鼠粪便及盲肠内容物中肠道菌群多样性,研究丹参茎叶多组分药物对糖尿病肾病小鼠肠道菌多样性的干预作用。本节实验结果显示,与空白组相比,模型组小鼠肠道菌群在门、属水平上均有显著性差异。模型组中 Lachnoclostridium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Eubacterium_nodatum_group、Firmicutes、Christensenellaceae、Lachnospiraceae_UCG-001、Coriobacteriaceae、Bacteroidales_S24-7_group、Lactobacillus、Ruminococcaceae_UCG-013、Eubacterium_coprostanoligenes group均发生了显著性变化。表明糖尿病肾病小鼠体内发生了一定程度的肠道菌群失调,同时丹参茎叶多组分能回调其肠道菌群的失衡,其中3种单体成分按照茎叶中存在比例配伍(TJ)、5种单体成分按照根中存在的比例配伍(VG)的高剂量组均表现出良好的回调效果,该结果可进一步证明TJ、VG可能为单体配伍的最佳比例。四、基于TGF-β/Smad信号通路的多组分改善糖尿病肾病作用机制研究本节实验以高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)体外氧化应激为模型,采用丹参茎叶多组分进行干预,ELISA法测定细胞上清液中细胞因子的表达、Western blotting及Real-time PCR检测各细胞中相关蛋白及其mRNA的表达量;同时以Western blotting法检测小鼠肾脏组织中相关蛋白的含量。实验结果发现,丹参茎叶多组分可通过调节氧化应激、TGF-β/Smad信号通路中相关蛋白的含量、回调其mRNA的表达水平,从而改善高糖条件下所导致的HK-2细胞凋亡并改善糖尿病小鼠肾组织的损伤。第四章 丹参茎叶多组分改善糖尿病肾病的代谢组学、转录组学及蛋白质组学研究一、丹参茎叶多组分改善糖尿病肾病的代谢组学研究本节实验采用代谢组学的分析手段,对糖尿病肾病小鼠的血清以及尿液样本进行内源性代谢物质检测,从体内代谢小分子物质的角度阐述丹参茎叶多组分对糖尿病肾病的改善作用。实验结果发现,糖尿病小鼠血清中可鉴定出14个潜在代谢物;尿液中可鉴定出68个潜在代谢物,给予丹参茎叶多组分后可不同程度地回调小鼠体内代谢紊乱。血清样本中内源性代谢物主要参与了醚脂类代谢、生物素代谢、类固醇激素生物合成、鞘脂代谢;尿液样本中内源性代谢物主要参与了泛醌和其他萜类醌生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺代谢。血清与尿液样本中的潜在代谢物可共同调节甾类激素生物合成以及鞘脂类代谢。二、丹参茎叶多组分改善糖尿病肾病的转录组学研究结合前期体外细胞活性实验以及体内药效作用评价筛选的结果,本节实验选取5组实验样本即空白组、模型组、阳性药(二甲双胍)组、3单体以茎叶比例配伍高剂量组(TJH)、5单体以根比例配伍高剂量组(VGH)小鼠的肾脏样本,进行转录组学实验,从转录本的层面阐明丹参茎叶多组分对糖尿病肾病的改善作用,探讨其分子机制。结合加权基因共表达网络(WGCNA)分析实验结果并经过基因数据库筛选后,本实验确定了 11个候选基因,分别为 Egr1、Foxo3、Pik3r3、Fgfl、Sost、Wnt1Oa、Tgif2、Akt2、Mep1b、Collal、Apoe,1 1个候选基因可涉及多条信号通路。三、丹参茎叶多组分改善糖尿病肾病的蛋白质组学研究本节实验采用蛋白质组学的研究手段,对五组实验样本即空白组、模型组、阳性药(二甲双胍)组、3单体以茎叶比例配伍高剂量组(TJH)、5单体以根比例配伍高剂量组(VGH)小鼠的肾脏样本进行高通量蛋白质组测定,从蛋白的层面阐述丹参茎叶多组分对糖尿病肾病的改善作用。实验结果表明,空白组与模型组比较后可筛选出539个显著性差异蛋白。对差异蛋白进行生物信息学分析(GO富集、KEGG富集、PPI分析)后,发现其主要涉及氧化磷酸化、脂肪酸降解等多种生物过程。同时结合前期转录组学中的差异表达基因以及WGCNA分析结果,确定了7个候选差异蛋白,即P61148、Q80XU3、Q91W43、Q61847、P19324、P24472、P52480。四、丹参茎叶多组分改善糖尿病肾病的多组学联合分析及机制探讨本节实验对前期代谢组学、转录组学以及蛋白质组学的数据进行联合分析处理,探索丹参茎叶多组分改善糖尿病肾病可能的作用机制。实验结果发现,有12个基因在蛋白组与转录组中共同上调,163个基因只在蛋白组中上调,20个基因只在基因组中上调;49个基因在蛋白组与转录组中共同下调,310个基因只在蛋白组中下调,16个基因只在基因组中下调。将代谢组学、转录组学、蛋白质组学两两联合比较时,发现其主要涉及的生物途径包括类固醇代谢过程、脂质代谢、细胞对葡萄糖刺激反应、类固醇结合、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢。三者联合分析时,其主要涉及的生物途径包括花生四烯酸代谢、ABC转运、癌症中的胆碱代谢,且前期实验结果中可见丹参茎叶能改善与该通路相关的基因及内源性小分子代谢物。五、丹参茎叶多组分改善糖尿病肾病分子机制验证本章采用荧光定量PCR对前期转录组学中筛选出的候选基因进一步验证,并推测其可能的分子机制。实验结果发现,空白组与模型组比较,除Akt2基因,其余候选基因差异倍数均较显著;Foxo3、Pik3r3、Fgfl、WntlOa、Mep1b基因P-Value有显著性。经药物调节后,模型小鼠体内的差异候选基因发生不同程度的改变,且二甲双胍和丹参茎叶多组分药物可能通过调节不同的分子途径,从而改善糖尿病肾病。二甲双胍组可显著性改变Foxo3、Fgfl、Sost、Akt2、Mep1b基因;三单体茎叶比例组、五单体根比例组可显著性调节Egr1、Pik3r3、Collal基因,其调节基因为PI3K/Akt/FoxO信号通路中的关键基因。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285
【图文】：

第二章丹参茎叶有效部位制备与化学成分分析条件逡逑ｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＣｉ８（２．１邋ｍｍｘｌＯＯｍｍ，１．７邋ｐｍ）色谱柱；柱温：（Ａ）－Ｏ．ｌ％甲酸水溶液（Ｂ），梯度洗脱（０￣ｌｍｉｎ，５％？５％Ａ；邋ｌ￣３３？７ｍｉｎ，１０％？１５％Ａ；邋７￣ｌｌｍｉｎ，１５％？２１％Ａ；邋ｌｌ￣１５ｍｉｎ，邋２７ｍｉｎ，３３％？７０％Ａ；邋１７￣１８ｍｉｎ，７０％邋？８０％Ａ；邋１８邋？２０ｍｉｎ，邋８０，８０邋％邋￣邋５邋％）；流速：０．４邋ｍＬ．ｍｉｎ－１；进样量：２邋ｎＬ；检测波长：２８０）和２５４邋ｎｍ邋（黄酮类成分）。混合对照溶液及丹参茎叶样品色谱图（２３

提取ｌｈ；醇提后药渣以料液比为１：邋８，水煎煮提取１次，提取ｌｈ，合并两次提取逡逑液，测定指标成分含量。实验结果表明，乙醇回流法对指标成分的提取率最高，故选择乙逡逑醇回流法对丹参茎叶药材进行提取，并进行单因素及正交试验考察优化提取工艺。见图２－２。逡逑５邋崖％「逦逦逡逑４．５００％逦■逦．逡逑ａ逡逑＜＾邋４．０００％邋？逡逑＇．５。。％逦．逦媻．：‘逡逑３．０００％逦逦＾逦逡逑超声逦乙醇回流逦乙醇＋水煎煮逡逑提取方法逡逑图２－２提取方法对指标成分总含量的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑２．３．２提取溶剂考察逡逑精密称取丹参茎叶药材粉末５份，每份５ｇ，以１：邋８料液比，提取２次，每次ｌｈ，考逡逑察提取溶剂即水和不同乙醇浓度（３０％、５０％、６０％、７０％、９０％）提取对丹参茎叶中酚酸类逡逑成分及黄酮类成分含量的影响。结果表明，丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分含量随乙醇浓逡逑度的升高而增长，在乙醇浓度为６０％时达到峰值，后随乙醇浓度的升高而下降。见图２－３。逡逑２０逡逑

精密称取丹参茎叶药材粉末５份，每份５邋ｇ，以６０％乙醇，提取２次，每次ｌｈ，考察逡逑不同料液比（１：８、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０）对提取成分总含量的影响。结果表明，当料液比逡逑为１：１５时，总含量达到峰值，不同料液比间含量无明显差异。见图２－４。逡逑５．５００％逡逑５．０００％邋，逦ｍｍ邋｜ｈ逡逑＿一＿邋Ｉ丨丨丨逡逑４．０００％邋￣—逡逑１：８逦１：１０逦１：１２逦１：１５逦１：２０逡逑料液比／（ｇ＾ｒｎＬ－１）逡逑图２－４料液比对指标成分总含量的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋ｍａｔｅｒｉａｌ邋ｔｏ邋ｌｉｑｕｉｄ逡逑２．３．４提取时间考察逡逑精密称取丹参茎叶药材粉末５份，每份５邋ｇ，以６０％乙醇，１：邋８料液比，提取１次，逡逑考察不同的提取时间（ｌｈ、１．５邋ｈ、２邋ｈ、２．５邋ｈ、３邋ｈ）对指标成分总含量的影响。结果表明，逡逑丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分含量随时间的增加而升高，在２ｈ时达到峰值，后随时间逡逑的增加而下降。见图２－５。逡逑４．５００％逡逑４．３００？／0邋－逡逑ｍ邋４．１００％邋－逡逑ｓ：：：：ｌ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑３．５００％邋￣—逡逑１逦１．５逦２逦２．５逦３逡逑提取时间／ｈ逡逑图２－５提取时间对指标成分总含量的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｔｉｍｅ逡逑２．３．５提取次数考察逡逑精密称取丹参茎叶药材粉末４份，每份５邋ｇ，以６０邋％乙醇，１：８料液比，提取时间为每逡逑２１逡逑

本文编号：2803006