肝靶向药物甘草次酸氨基酸衍生物的设计、合成及活性评价

发布时间：2020-08-25 02:20

【摘要】：研究背景:甘草次酸是从中药甘草中分离得到的有效成分,研究证实甘草次酸具有抗肿瘤作用,同时在肝细胞中有丰富的结合位点,具有明确的肝靶向性。当前,以甘草次酸为母核,通过结构修饰,发现靶向抗癌药物是国内外研究的热点。实验室前期合成的TOGA与TNGA,是川芎嗪小分子与甘草次酸羧基位分别以酯键和酰胺键相连的化合物,通过体外活性测定发现两结构抗癌活性并不显著。结合实验室前期工作基础及相关文献报道发现引入氨基酸残基对药物活性增强有着重要作用,同时可降低细胞毒性,在一定程度上增强其靶向作用,为高效低毒抗癌药物的发现提供重要的方向。研究目的:本课题意在对实验室前期合成的甘草次酸衍生物TOGA及TNGA深入进行结构改造并增强其抗肿瘤活性。基于甘草次酸结构本身的靶向性,结合拼合原理及化合物活性改善方法,将氨基酸小分子引入衍生物结构中,以提高其生物利用度及靶向性,进而提高其抗癌活性。同时结合相关机制及成药性探究,发现高效、低毒的靶向抗癌药物。研究内容:本实验以TOGA及TNGA为结构修饰前体,通过引入不同类型的氨基酸残基合成系列甘草次酸氨基酸衍生物,并通过核磁、质谱等手段确证其化学结构。将合成的系列化合物通过5种癌细胞模型(HepG2人肝癌细胞模型,Hela人宫颈癌模型,A549人肺癌模型,BGC-823人胃癌模型,MDCK犬肾上皮细胞)进行活性评价,通过MTT法对化合物抗癌活性进行验证,筛选出高效低毒的优势化合物。后期对初步活性测定得到的优势化合物进行构效关系研究,确认其起效官能团,推断可能的作用机制并进行验证。对优势化合物的体外血浆及肝微粒体稳定性进行探究,结合药代动力学、药物体内分布及裸鼠移植瘤实验,对化合物成药性及肝靶向性进行初步评价,为新药的后续开发提供必要的依据。研究结果:本实验通过化学拼合原理合成甘草次酸氨基酸衍生物34个,通过细胞MTT实验对其进行体外抗癌活性筛选,结果显示大部分化合物较起始物活性得到增强,其中化合物TOGA-X1,TOGA-X4,TOGA-X5,TOGA-X17抗癌效果甚至强于阳性药顺铂,对MDCK正常细胞杀伤作用进行评价后,最终得到高效低毒的抗癌先导化合物TOGA-X4。通过对化合物结构母核及药效基团进行替换增减,结合细胞活性实验,对候选药物进行构效关系分析,最终确定TOGA-X4为候选药物。结合细胞染色法及流式细胞术,发现TOGA-X4能够诱导HepG2细胞出现早期凋亡。通过体外稳定性实验探究,发现化合物TOGA-X4在体外大鼠血浆孵育2 h后剩余化合物含量62.7%,体外大鼠肝微粒体孵育1h后剩余化合物含量71.3%,可认为该化合物在体外基本稳定。对TOGA-X4进行微球制剂,提高其水溶性,通过大鼠尾静脉注射进行体内药代动力学实验,发现化合物在体内血浆中6h和12h浓度明显升高。通过动物体内分布实验探究,发现在心、肝、脾、肺、肾五个脏器中,化合物在肝脏中分布随时间增加逐渐增多,最终趋于稳定,可认为该化合物具有明显的肝靶向性。裸鼠移植瘤实验结果表明,TOGA-X4给药剂量为80mg/kg时,抑瘤率达49.5%,但在肝脏,肾脏和心脏中的耐受性和安全性与5-Fu相比要好得多,证明该化合物具有良好的安全性。研究结论:起始物TOGA和TNGA经结构修饰后,活性明显增强,且TOGA衍生物抗癌活性普遍强于TNGA衍生物,其中筛选出的低毒高效候选药物TOGA-X4能够对肝癌细胞进行有效杀伤,而对正常细胞杀伤较小,能够促进肝癌细胞的早期凋亡。在体外血浆及肝微粒中能够较为稳定的存在,结合药代动力学实验,体内分布实验及药效学实验表明TOGA-X4能够定向进入肝脏中,具有良好的肝靶向作用。裸鼠移植瘤实验结果表明该化合物具有良好的体内抑瘤效果,达到了本课题的研究目的,为新药的研究与开发奠定了基础。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285
【图文】：

逡逑取“一步法”反应液少量，处理后进样，如图２－４液相色谱图所示，峰１保留时间为逡逑５．５０６邋ｍｉｎ，结合薄层监测，分离纯化该反应液，得到纯度较高的峰１化合物，反应产率逡逑５０％左右。通过质谱对峰１进行结构确认，如图２－５所示，确定该化合物为ＴＭＰ－Ｃ１。逡逑１逡逑ｆｔ逦Ｉ逡逑Ｉ邋＼邋Ｉ邋＼逦／邋＼逡逑逦］邋Ｖ＿＿！邋Ｖ．邋！邋＼逦逦逦逦逦逡逑0逦２．５逦５．０逦７．５逦１０．０逦１２．５逦１５．０逡逑ｃ／ｍｉｎ逡逑图２－４邋“邋一步法”合成２－氯甲基－３，５，６－三甲基吡嗪反应液ＨＰＬＣ色谱图逡逑ｘＩＯ邋５｜逦、Ｎ邋八逡逑离邋４－逦１７．０６８２邋ｙ＾Ｃ，逡逑１逡逑１逡逑度ｈ逡逑°邋￣１００邋１２０邋１４０邋１６０邋１８０邋２００邋２２０邋２４０邋２６０邋２８０邋３００逡逑ｍ＇ｚ逡逑图２－５峰１化合物结构解析逡逑２．１．３．２“四步法”反应监测结果逡逑对“四步法”每步反应液进行收集，分别处理进样，液相色谱图观察其反应情况，通逡逑过对各步骤反应液监测，发现“四步法”各步反应产率较高，在实际操作过程中，可直接逡逑进入下步反应，减少了分离纯化过程中带来的化合物损失，最终反应产率高达８０％。同逡逑时对各步反应产物进行质谱分析

图２－７各步反应产物离子流图及结构解析逡逑Ａ．步骤ａ反应产物结构解析；Ｂ．步骤ｂ反应产物结构解析；Ｃ．步骤ｃ反应产物结构解析；Ｄ．步骤ｄ反逡逑应产物结构解析逡逑对“一步法”与“四步法’’ＴＭＰ－Ｃ１反应液进行薄层监测［Ｖ邋（二氯甲烷）：Ｖ邋（甲醇）逡逑＝邋１００：１］，如图２－８所示，右侧为ＴＭＰ－Ｃ１对照品，左侧为反应液，中间为交叉点；“一步逡逑法”薄层板监测反应产物下方为川芎嗪原料，反应不完全且杂质较多，杂质极性与反应逡逑产物相近，较难分离；“四步法”薄层板监测，原点为催化剂等强极性物质，分离纯化时逡逑不会对产物造成影响，如图所示，该方法反应较为完全，杂质量少且极性与反应产物相逡逑差较大，分离纯化简单易得。逡逑３８逡逑

Ｃ逦Ｄ逡逑图２－６各步反应液ＨＰＬＣ色谱图逡逑Ａ．步骤ａ反应液；Ｂ．步骤ｂ反应液；Ｃ．步骤ｃ反应液：Ｄ．步骤ｄ反应液逡逑0逡逑ｘ１０６逦Ａ逦ｘ１０５逡逑１邋７５逦１５３，１０２０逦８｜逦１９５．１１２９邋ＶＮＹ＾0Ａｃ逡逑离１５逦ＸＸ逦氧ｉ逦＼邋入义逡逑子邋１．２５逦？逦Ｓ逡逑｜逦｜邋；逡逑兮０．７５逦号「逡逑强0５逦强＾逡逑？又邋０．２５逦汊邋１．逦２５３．１１８４逡逑°逦１００邋１邋２０邋１４０邋１６０邋１邋８０邋２００邋２２０邋２４０邋２６０邋２８０邋３００逦°逦１００邋１２０邋１４０邋１６０邋１８０邋２００邋２２０邋２４０邋２６０邋２８０邋３００逡逑ｍ／ｚ逦ｍｌｚ逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ｘ１０６，逦、Ｎ邋ａ逦ｘｌＯ邋５［逦、Ｎ邋八逡逑＇邋１Ｔ逦“邋”一邋Ｘ（ＣＩ逡逑辜邋０．８＿逦Ｊ逦３－逡逑倍逡逑ｌ°＇６ｉ逦１逦－逡逑｜°１逦—逦１邋ｉ逦，逡逑ｆ。．２邋Ｉ邋，逦Ｉ逡逑0ｌ邋１００邋１；（ｉ邋ｊｊ0邋１６０邋１８０邋？６0逦２４０邋？６0＇邋＾0４0逦＾邋ｉ６0邋＿硕＿＿说逦？油输洳洳妯邋３００逡逑ｍ／ｚ逦ｍ／ｚ逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑图２－７各步反应产物离子流图及结构解析逡逑Ａ．步骤ａ反应产物结构解析；Ｂ．步骤ｂ反应产物结构解析；Ｃ．步骤ｃ反应产物结构解析；Ｄ．步骤ｄ反逡逑应产物结构解析逡逑对“一步法”与“四步法’’ＴＭＰ－Ｃ１反应液进行薄层监测［Ｖ邋（二氯甲烷）：Ｖ邋（甲醇）逡逑＝邋１００：１］，如图２－８所示，右侧为ＴＭＰ－Ｃ１对照品，左侧为反应液，中间为交叉点；“一步逡逑法”薄层板监测反应产物下方为川芎嗪原料

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本文编号：2803135