奇果菌素对卵巢癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及机制研究

发布时间：2020-08-26 16:16

【摘要】：背景:卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,它的发病率位列宫颈癌和子宫内膜癌之后,排名第三。但其死亡率位居妇科肿瘤的首位,是妇科肿瘤患者最主要的致死原因。目前,相关的统计资料表明导致女性死亡的各类恶性肿瘤中,卵巢癌的致死率位列第五位。因此,卵巢癌被视为一种严重危害女性身体健康以及生命安全的疾病。卵巢癌病理组织分型复杂多样,其中上皮性卵巢癌所占比例最高,约为85%-90%。尽管医学的诊断、治疗水平不断提高,影像、检验等检查手段日益先进,但由于卵巢癌起病隐匿,早期患者缺乏典型的症状和体征,医疗机构缺少有效的、敏感的早期检查、检验手段,以致大约70%的卵巢癌患者临床确诊时己进展到肿瘤晚期(FIGO分期Ⅲ/Ⅳ),手术治疗效果欠佳,加之卵巢癌容易复发、转移的特点,致使晚期卵巢癌患者在接受了规范化、系统化的治疗后,5年的生存率仍然很低,仅有30%左右。当前,卵巢癌的标准治疗方案是手术治疗,术后辅助以铂为基础的联合化疗,但化学药物治疗可能出现明显的毒副作用,如恶心、呕吐的消化道症状、骨髓造血的抑制作用,肝肾功能的毒性损伤等等,影响了患者的生活质量以及治疗依从性,并且更为严重的是,部分患者出现了化疗耐药,影响了治疗效果。因此,寻找高效的、新型的、毒副作用小的抗卵巢肿瘤新药物,以期提高卵巢癌治疗效果,改善卵巢癌预后,逆转化疗耐药,成为摆在我们面前,急需解决的问题。随着对抗癌药物的不断研究,目前人类发现170余种抗肿瘤的小分子化合物,非人工合成的有130余种,其中近50%的化合物为真菌提取物,它们具有稳定的化学结构、独特的分子活性,在抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、阻止细胞转移、诱发细胞自噬等方面发挥重要作用。部分真菌提取物已经应用于抗肿瘤的临床治疗中,比如从云芝中萃取的云芝多糖-PSK(Krestin),从蘑菇的毒素中提取的Irofulven(中文名伊罗夫文)等药物,在临床治疗中取得了不错的疗效,表明这类小分子化合物具有明显的抗癌作用。卵巢癌严重危害女性健康甚至生命,尽管对卵巢癌的研究不断深入,治疗手段不断进步,但多年来,卵巢癌的治疗效果没有大的突破,一直处于平台期,从真菌提取物中寻找、发现治疗卵巢癌的新物质是我们的目标。奇果菌素(Grifolin,2-trans,trans-farnesyl-5-methylresorcinol),英文名称grifolin,分子式为C22H32O2,分子量为328,是一种从地花蘑菇子实体中分离出的二级代谢产物,它类属于担子菌类,在化学构成上,是一种法尼基酚类小分子化合物,具有调节血脂、抗病毒、调节免疫、抗肿瘤的作用,以往研究表明奇果菌素能够抑制多种肿瘤细胞的生长,如人乳腺癌细胞MCF7,人结肠癌细胞SW480,人宫颈癌细胞Hela、慢性粒细胞白血病细胞K562等细胞。奇果菌素通过多种方式、多条途径发挥抗癌作用,比如奇果菌素能够通过ERK5通路,阻断鼻咽癌细胞周期进程,抑制肿瘤细胞生长。Luo XJ等学者还发现在鼻咽癌细胞中,奇果菌素能通过P53信号通路,上调DAPK1,促进肿瘤细胞的死亡,控制癌症的进展,该团队通过研究还证实奇果菌素能够通过调控ERK1/2-EIk1-DNMT1信号传导通路,调节上皮转移因子的表达,干扰肿瘤细胞的黏附、侵袭,揭示了奇果菌素抑制肿瘤细胞转移的作用。此外,研究发现奇果菌素能够调节骨肉瘤细胞的Akt通路,促进其自发的程序化死亡,即凋亡。以上研究揭示了奇果菌素具有巨大的抗癌潜能,表明它在抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡、控制其侵袭、转移等方面都有显著的作用。研究目的:奇果菌素是一种天然小分子化合物,具有广谱的抗肿瘤活性,在多种肿瘤细胞中发挥抗癌作用,其在上皮性卵巢癌细胞中的作用至今无相关的报道,本研究旨在探索其对上皮性卵巢癌细胞的影响以及相关的分子作用机制。1.方法:本研究在体外培养上皮性卵巢癌细胞系A2780、SKOV3和HO8910细胞,对细胞施加不同浓度的奇果菌素,分别作用不同的时间,然后进行MTT、平板克隆、流式细胞仪测定细胞周期、Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡、Western-Blot检测蛋白分子、构建体外移植瘤进行药物处理、高通量测序及相关生信分析等一系列的实验,得出实验数据,进行相关的统计分析。1.1细胞增殖实验(MTT实验)应用四甲基偶氮唑盐摄取法检测不同浓度的奇果菌素分别作用A2780、SKOV3和HO8910细胞不同的时间,再经过一系列的处理与检测后,计算出细胞的生存率。1.2平板克隆实验收取处于对数生长期的增殖活跃细胞,种植于六孔板,施用不同浓度的奇果菌素作用48小时后,再用不含奇果菌素的培养基继续孵育细胞,后经固定、染色等处理后,计数细胞克隆形成数。1.3细胞周期实验不同浓度的奇果菌素作用卵巢癌细胞后,通过降解RNA,PI标记DNA等处理后,FACScan flow cytometry测定各周期时相的细胞数,检测结果用WinMDIv2.9软件进行分析。1.4细胞凋亡实验用含不同浓度梯度奇果菌素的培养基预处理A2780、SKOV3、HO8910细胞,施加一系列相关处理后,加入碘化丙啶(propidium iodide)和膜联蛋白(FITC-Annexin)进行染色标记,然后用FACScan flow cytometry进行细胞凋亡检测,检测结果用WinMDI v2.9软件进行分析。1.5蛋白质印迹实验Western-Blot实验方法检测卵巢癌细胞A2780、SKOV3、HO8910被不同浓度的奇果菌素作用后,与细胞周期、细胞凋亡、信号通路相关的蛋白分子如 CyclinD1、Bcl-2、Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP、p-ERK1/2和p-Akt等的表达变化。1.6体内实验验证奇果菌素对卵巢癌细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用采用皮下注射的方式构建裸鼠卵巢癌细胞SKOV3的皮下移植瘤模型,采取胃灌注的方式对裸鼠施用奇果菌素。自皮下种植肿瘤细胞的第一天始,药物处理组每天灌注玉米油溶解的奇果菌素,对照组灌注同等量玉米油。待对照组最大瘤体直径生长至1.5cm时,处死小鼠并取瘤称量,固定后行免疫组化检测Ki67、CDK4、CyclinD1、Bcl-2、Bax等分子的表达,并与对照组进行比较。1.7生物信息学分析通过高通量测序比较经过Grifolin处理和对照组卵巢癌细胞mRNA的差异,并应用qRT-PCR、Western Blot及免疫组化等技术,探索Grifolin对卵巢癌细胞生物学作用的分子机制。1.8统计方法为保证结果的严谨、准确,所有数据的获得均通过三次不同的实验,并采用均数±标准差的形式予以表达,所得数据用SPSS18.0软件进行t检验和方差分析,P0.05表示有统计学意义。2.结果2.1奇果菌素抑制卵巢癌细胞的生长MTT实验方法检测奇果菌素作用前后的卵巢癌细胞A2780、SKOV3和HO8910的生长率,实验数据表明,奇果菌素对卵巢癌细胞的生长有明显的抑制作用,并且表现出明显的时间依赖性以及浓度依赖性。2.2奇果菌素降低卵巢癌细胞的集落形成力平板克隆实验检测奇果菌素对单个卵巢癌细胞的增殖影响,统计数据表明,随着药物浓度的增加,单个细胞的活力降低,增殖数减少,克隆数降低。2.3奇果菌素阻滞卵巢癌细胞的周期进展细胞周期实验检测了不同浓度奇果菌素作用于A2780、SKOV3和HO8910细胞后,细胞周期的分布情况,实验数据表明,随着药物浓度的增加,G1时相的细胞比例逐渐升高,说明奇果菌素阻滞细胞周期于G1期。2.4奇果菌素促进A2780、SKOV3和HO8910细胞的凋亡FITC-Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡试验,对比了奇果菌素处理前后的A2780、SKOV3、HO8910细胞的凋亡数量,数据显示,早期凋亡的细胞比例随奇果菌素的浓度加大而逐渐攀升,晚期凋亡或坏死的细胞比例也出现了小幅递增,表明随着奇果菌素浓度的加大,细胞凋亡比例逐渐递增。2.5 Western-blot法检测了相关蛋白分子的表达变化奇果菌素抑制了 CyclinD1和CDK4的蛋白分子表达,阻断卵巢癌A2780、SKOV3、HO8910细胞从G1期进入到S期。奇果菌素增加了Caspase-3和PARP剪切片段的表达,改变了 Bax/B cl-2的比值,促进了细胞的凋亡。2.6体内实验表明奇果菌素可抑制卵巢癌细胞增殖、促进卵巢癌细胞凋亡裸鼠皮下种植SKOV3细胞后,随机分为对照组和实验组,自皮下种植肿瘤细胞的第一天起,两组小鼠分别胃灌注玉米油溶剂和溶有奇果菌素的玉米油。生长曲线显示奇果菌素处理组卵巢癌细胞在裸鼠体内有更慢的增殖速度,药物处理组移植瘤平均重量明显小于对照组。移植瘤进行染色分析示,对照组Ki67、CDK4、CyclinD1染色深染,表明其更强的增殖能力,而药物处理组Ki67、CDK4、CyclinD1染色变浅,表明增殖能力减弱,药物处理组相比于对照组Bax染色深染,Bcl-2染色变浅,表明药物促进了其凋亡,体内实验表明奇果菌素有效抑制卵巢癌细胞增殖并促进其凋亡。2.7高通量测序结果显示,奇果菌素处理后,卵巢癌细胞中PI3K/Akt和ERK1/2通路明显被抑制,分子生物学实验证实经过Grifolin处理后,卵巢癌细胞中Akt和ERK1/2的磷酸化水平明显降低,经过Grifolin处理后,移植瘤中p-ERK和p-Akt染色变浅,表明药物抑制了 ERK和Akt的磷酸化。3.结论3.1奇果菌素抑制卵巢癌细胞的增殖,将细胞有丝分裂阻滞于G1期,减缓了细胞的分裂增殖。3.2奇果菌素诱导了卵巢癌细胞发生凋亡。3.3上皮性卵巢癌细胞系存在ERK1/2和PI3K/Akt通路的活化,奇果菌素能够下调ERK1/2和Akt的磷酸化水平,其抗癌作用的发挥与降调ERK1/2和PI3K/Akt通路的活性有关。3.4构建动物模型,进行体内实验进一步证实奇果菌素可以抑制卵巢癌细胞增殖、促进卵巢癌细胞凋亡。3.5奇果菌素具有独特、稳定的分子结构,显著的抗癌作用,它为卵巢癌的治疗提供了新的思路,值得进一步研究。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

菌素,卵巢癌细胞,克隆形成,实验检测

图１．２：奇果菌素抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力逡逑（Ａ－Ｃ）不同浓度的奇果菌素处理卵巢癌细胞Ａ２７８０（Ａ）、邋ＳＫＯＶ；３（Ｂ）逡逑Ｈ０８９ｌＯ（Ｃ）后，通过克隆实验检测单个细胞的增殖与克隆形成能力，逡逑实验数据应用均数±标准差表示，实验各重复三次，实验结果表明，随着逡逑奇果菌素药物浓度的加大，集落形成数减少，克隆能力降低。逡逑＜０．０５ｖｓ0ｎＭ邋对照组。逡逑４９逡逑

菌素,卵巢癌细胞,克隆形成

５０逦７５逡逑图１．２：奇果菌素抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力逡逑（Ａ－Ｃ）不同浓度的奇果菌素处理卵巢癌细胞Ａ２７８０（Ａ）、邋ＳＫＯＶ；３（Ｂ）逡逑和Ｈ０８９ｌＯ（Ｃ）后，通过克隆实验检测单个细胞的增殖与克隆形成能力，逡逑实验数据应用均数±标准差表示，实验各重复三次，实验结果表明，随着逡逑奇果菌素药物浓度的加大，集落形成数减少，克隆能力降低。逡逑Ｐ＜０．０５ｖｓ0ｎＭ邋对照组。逡逑４９逡逑

菌素,分子基础,诱导细胞凋亡,抑制细胞

５０逦７５逡逑图１．３：奇果菌素阻滞卵巢癌细胞周期的进展逡逑（Ａ－Ｃ）分别用邋２５（ｉＭ、５０｜＾Ｍ、７５）＾Ｍ邋奇果菌素处理邋Ａ２７８０（Ａ）、逡逑ＳＫ０Ｖ３（Ｂ）和ＨＯ８９１０（Ｃ）细胞２４小时后，力口用乙醇固定细胞，后经ＲｎａｓｅＡ逡逑和ＰＩ等试剂处理细胞，最后应用流式细胞技术对细胞周期进行测定，发逡逑现随着奇果菌素药物浓度梯度的增加，处于Ｇ１期的细胞比例逐渐增加，逡逑试验数据是三次不同试验的累计。Ｐ＜０．０５ｖｓ０ｆｉＭ对照组。逡逑５０逡逑

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