齐墩果酸诱导HSC-T6细胞转变为成纤维细胞的研究

发布时间：2020-08-27 07:30

【摘要】：目的:以HSC-T6细胞为模型,探索齐墩果酸(Oleanic acid,OA)导致肝纤维化的机制。方法:1.观察OA对HSC-T6细胞的影响通过MTT法筛选OA浓度后,设置空白组、低剂量组(10μM)、中剂量组(20μM)、高剂量组(40μM),给予齐墩果酸24 h后,采用WB法检测α-SMA、SHH、TGF-β1、Smad2与核内Nrf2、Gli2蛋白水平,ELISA法检测培养基中Ⅰ型胶原含量。2.建立Nrf2的转染与激动以及HH通路、TGF通路的沉默方法(1)采用siRNA方法处理HSC-T6细胞,RT-PCR法检测Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLC、GCLM mRNA表达,WB法检测核内Nrf2蛋白水平;(2)采用5μM SFN处理HSC-T6细胞24 h后,检测Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLC、GCLM mRNA表达和核内Nrf2蛋白水平;(3)将1μM吡非尼酮与HSC-T6细胞共同孵育24 h后,检测TGF-β1mRNA水平与蛋白水平;(4)HSC-T6细胞用8μM的Gant-61处理24 h后,检测核内Gli2蛋白水平。3.探讨Nrf2通路、HH通路与TGF通路对OA导致肝纤维化的作用(1)分别用0,10,20,40μM的OA与正常的及si Nrf2 HSC-T6细胞共孵育;(2)给予0,10,20,40μM的OA,同时将5μM SFN与0,10,20,40μM的OA联合给药;(3)给予0,10,20,40μM的OA同时设置平行组在给予OA的同时给予8μM Gant-61。给药24 h后,检测8个组α-SMA蛋白水平与Ⅰ型胶原含量;(4)设置空白组、OA低剂量组、OA中剂量组、OA高剂量组、吡非尼酮组、吡非尼酮+OA低剂量组、吡非尼酮+OA中剂量组、吡非尼酮+OA高剂量组;结果:1.给予OA 24 h后,中、高剂量组α-SMA与Ⅰ型胶原含量明显增多,表明大剂量的OA能导致HSC-T6细胞的活化。与空白组相比,中、高剂量组核内Nrf2蛋白水平上调,SHH与、Gli2蛋白水平上调,高剂量组TGF-β1、Smad2蛋白水平上调。2.PCR结果显示siRNA处理后Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLC、GCLM mRNA水平明显下调,WB结果显示siRNA方法能够显著降低核内Nrf2蛋白水平,表明siRNA沉默Nrf2成功;空白组与低剂量组采用siRNA沉默Nrf2后,α-SMA蛋白水平上调、Ⅰ型胶原含量增多;高剂量组采用siRNA沉默Nrf2后,α-SMA蛋白水平下调、Ⅰ型胶原含量减少。3.给予SFN后,Nrf2下游基因mRNA水平明显升高,核内Nrf2蛋白水平明显升高,表明SFN能够激动Nrf2蛋白水平;SFN与OA联合给药后,发现SFN能使HSC-T6细胞α-SMA蛋白水平下调,Ⅰ型胶原含量降低。4.给予Gant-61后,核内Gli2蛋白水平明显降低,表明Gant-61能有效抑制HH通路;与OA联合给药后,α-SMA蛋白水平明显下调,Ⅰ型胶原含量降低。5.吡非尼酮能够显著降低TGF-β1 mRNA水平以及蛋白水平,表明吡非尼酮是TGF-β1的有效抑制剂;与OA各剂量组相比,给予吡非尼酮后HSC-T6细胞的α-SMA蛋白水平下调,Ⅰ型胶原含量降低。结论:大剂量的OA可以导致HSC-T6细胞活化,Nrf2通路在OA所致肝纤维化的过程中起部分保护作用,OA可能通过HH通路与TGF-β通路导致肝纤维化。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

161 传代前与传代后 24, 48, 72 h α-SMA 蛋白水平与Ⅰ型胶原筛选药物浓度A 给药剂量为 0、10、20、40 μM；Nrf2 激动剂 SF；TGF-β1 抑制剂吡非尼酮的浓度为 0、0.5、1、2 μ0、1、2、3、8 μM，进一步检验激动剂/抑制剂各浓（图 2）。

给予OA后α-SMA蛋白水平与Ⅰ型胶原含量响（与空白组相比*P<0.05，与低剂量组相比#P<0.05，n=3）

给予OA后核内Nrf2蛋白水平（与空白组相比*P<0.05，n=3）

【参考文献】

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本文编号：2805810