基于“药载合一”的蜗牛黏液—丹皮酚凝胶制备及其抑瘢性能考察

发布时间：2020-08-28 17:26

　　研究背景增生性瘢痕(Hypertrophic Scars,HS)是一类特发于人类的难治性皮肤疾病,由于发病因素多样和缺乏理想动物模型,一直是困扰创伤修复领域的难题。中医学认为HS属于疽证,治则软坚散结、活血化瘀,应防治结合。本课题将生物黏附材料——蜗牛黏液设计成给药载体,传输中药牡丹皮活性成分-丹皮酚,以期发挥协同抑瘢性能,制备一种新型的纳米凝胶制剂,进行安全性、释药性能和药效学研究,为防治增生性瘢痕提供一种皮肤药物治疗途径。目的研制蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂,优化蜗牛黏液-丹皮酚纳米粒的处方和制备工艺,考察其体外透皮性能及真皮滞留效应,并进行新西兰兔的皮肤刺激性及抑瘢效果考察,为该制剂进一步研究增生性瘢痕的预防和治疗提供理论依据。研究方法(1)对蜗牛黏液的成分尿囊素和羟基乙酸进行定量测定,考察其理化性质及生物相容性。(2)蜗牛黏液-丹皮酚纳米粒的制备及其质量考察。以包封率为评价指标,单因素试验筛选出显著因素,采用Box-Behnken响应面法优选纳米粒的制备工艺,透射电镜观察纳米粒形态,激光粒度仪测定粒径及Zeta电位。制备蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂。(3)蜗牛黏液-丹皮酚凝胶剂的质量考察。考察质量性质,包括外观性状、黏度、离心试验及含量测定;考察真皮滞留量,比较蜗牛黏液-丹皮酚凝胶剂及丹皮酚普通凝胶在三种不同动物离体皮肤中丹皮酚的皮肤滞留量及透皮速率,并绘制体外渗透曲线;考察皮肤刺激性,采用左右对比法观察皮肤有无红斑及水肿现象,并对给药部位的皮肤进行组织切片HE染色观察成纤维细胞的生长形态变化。(4)抑瘢性能药效学试验初步考察。建立兔耳增生性瘢痕模型,将新西兰兔随机分为模型组、空白组、阳性药物组、蜗牛黏液凝胶组(HAM-Gels)与蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂组(PAE-HAM-Gels),涂药28天后计算各组的瘢痕增生率,测量各组瘢痕增生指数(SEI),光镜下观察瘢痕组织块的HE染色与Masson染色后组织增生情况,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测各组TGF-β1的表达水平。结果(1)得到一种蜗牛黏液的定性定量检测方法,能同时测定有效成分尿囊素和羟基乙酸的含量。本实验所用蜗牛黏液的生物相容性良好,对SD大鼠无皮肤刺激性。(2)蜗牛黏液-丹皮酚纳米粒最优制备工艺为:称取丹皮酚26 mg加入无水乙醇2 m L溶解,超声混匀,400 r·min-1磁力搅拌30℃下以6.5%V/min的注入速度匀速注入至0.6g蜗牛黏液(5 m L p H7.4PBS缓冲液溶解)中;滴完后继续搅拌20 min,挥去乙醇,将得到的溶液用超声波破碎仪在冰水浴条件下超声10 min(120 W,超声2 s,间歇2s),得到纳米粒测的包封率值为(81.64±2.44)%,平均粒径(182.43±16.8)nm,Zeta电位(8.33±0.90)m V。(3)蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂粘度在6.6~7.4 Pa·S之间,p H值在7.0~7.5之间,含量为(3.04±0.08)mg·g~(-1);蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂体外释药曲线符合Higuchi方程,皮肤滞留效果显著。对于新西兰兔无皮肤刺激性。(4)蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂组的瘢痕增生率为62.50%,低于其他各组;SEI为(2.17±0.33),TGF-β_1为(815.4±34.69)ng·L~(-1),与模型组比较具有统计学意义(P0.01)。与模型组比,蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂组成纤维细胞排列杂乱无序,软骨细胞排列疏松,较规则,炎症细胞较少。结论本课题建立的质量控制方法,符合药典要求;通过BoxBehnken效应面法优化丹皮酚纳米粒的制备工艺,处方工艺合理可行;蜗牛黏液-丹皮酚凝胶剂具有缓释作用,真皮滞留量较显著;蜗牛黏液-丹皮酚复合凝胶剂安全性高,无皮肤刺激性,对兔耳增生性瘢痕有一定的治疗效果,具有良好的应用前景。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R283.6;R285
【部分图文】：

科学假说,课题,蜗牛,黏液

液中含有一种 achasin 活性化合物，作为一种受体，与细菌酶结合干扰酶活性以防止细菌分裂，可抑制细菌的形成[50]。进一步的研究发现，在伤口愈合过程中，蜗牛黏液可抑制炎症反应，加速创口处的修复，因此蜗牛黏液在皮肤修复领域正得到应用，并有潜力成为一种置于伤口的生物制剂[51]。1.5 课题研究的意义和创新点对于 HS 应防治结合，在创口愈合早期采取措施，抑制 HS 形成。成纤维细胞增殖主要发生在真皮层部位，因此抑瘢性能发挥的关键在于真皮层滞留药物浓度大小。本课题根据蜗牛黏液的良好生物相容性和生物载体特性，包载抑瘢药物丹皮酚，制备的蜗牛黏液-丹皮酚纳米粒及其凝胶剂型，使得蜗牛黏液附于皮肤外表以促进伤口愈合，丹皮酚可进入受损皮肤真皮层，进而抑制增生性瘢痕的形成。科学假说见图 1。通过制备蜗牛黏液-丹皮酚凝胶（PAE - HAM - Gels），考察其应用的安全性和稳定性，进一步通过药效学试验验证其抑制 HS 的作用。

混合对,溶液,羟基乙酸,尿囊素

2-1 空白对照品(A)、混合对照品（B）和供试品溶液（C）的 HPL（1.羟基乙酸；2.尿囊素）-1 Chromatograms of the mixed standards（A）and the testing sampl曲线绘制取 2.1.2 项下不同浓度的混合对照品溶液，经 0.22 μm 微0μL 注入高效液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品色谱峰峰面积 A 为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程表 2-1 羟基乙酸和尿囊素的线性关系Tab. 2-1 Linearity relationship of Glycolic acid andAllantoin分回归方程 r 线性乙酸 A = 17.267ρ + 3.2684 0.9994 0

色谱图,羟基乙酸,尿囊素,图谱

0.0058 0.0053 0.0108 95.70 0.0111 100.600.0109 96.960.0058 0.0079 0.0138 101.27 0.0136 99.050.0135 98.09检测限测定取 20.6 mg·mL-1羟基乙酸对照品溶液和 5.7 mg· 至 10 mL 容量瓶中，用 1 mg/mL 的磷酸盐缓冲液g·mL-1羟基乙酸对照品溶液和 0.57 mg·mL-1尿囊述对照品溶液 1 mL 至 10 mL 容量瓶中，得 0.206 0.057mg·mL-1尿囊素对照品溶液，测试色谱图 3.206 mg·mL-1，尿囊素对照品定量限为 0.057mg1A

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