巴天酸模抗肿瘤活性组分的筛选

发布时间：2020-08-31 14:45

　　目的:巴天酸模属于蓼科酸模属植物,为土大黄的药物来源之一。主产于我国东北、华北及西北各省,其药用部位为根部,性味苦酸寒,有清热解毒、活血止血、通便杀虫的功效。建立离线二维反相/反相色谱体系,对巴天酸模乙酸乙酯萃取部位中的化学成分进行系统分离,并为巴天酸模中活性成分的筛选以及微量化合物标准品的制备提供快速分离的方法;基于目前化学成分及药理作用的研究基础,本课题对该植物中的蒽醌类苷成分进行提取富集,并对其化学成分进行定性分析和色谱分离;对分离得到的组分进行体外抗肿瘤活性筛选,得到活性较好的组分并进行体外抗肿瘤活性测定,计算每个活性组分的IC_(50)值,评价并比较其抗肿瘤效果。方法:采用离线二维液相色谱技术,使用新型反向材料环氧四氮唑色谱柱与Unitary C18色谱柱,对巴天酸模进行分离、分析;通过系统溶剂萃取法,固相萃取技术和高压制备液相色谱技术,对巴天酸模中的蒽醌苷类成分进行提取和高效率、高自动化的分离;采用超高效液相/质谱联用(UHPLC-MS)技术对巴天酸模中的蒽醌苷类组分进行定性分析,明确其中的化学成分;应用CCK-8法对分离得到的组分进行体外抗肿瘤活性筛选及分析;最终应用UHPLC-MS技术对活性组分进行分析,推测其主要成分。结果:建立了离线反相/反相二维液相色谱(2D-LC)分离方法;通过色谱分离得到31个蒽醌苷类组分;在UHPLC-MS定性分析中,明确了巴天酸模蒽醌苷类组分的19个化学成分;经细胞活性筛选及分析后,得到4个有明确抗肿瘤活性的组分,即BTS-F1-19、BTS-F1-20、BTS-F1-21和BTS-F2-8。对这些活性组分进行深入地抗肿瘤活性测定后,发现BTS-F1-19抗肿瘤效果稳定,对肿瘤细胞的抑制率均较好。结论:本文的结果为巴天酸模化学成分的分离分析,以及进一步抗肿瘤机制的研究提供了可靠的依据。
【学位单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

四氮唑,巴天酸模,环氧,色谱柱

4 木脂素类 220 - 240 nm280 - 290 nm4 蒽醌类 240 - 260 nm 苯环结构；262 - 295 nm 醌类结构；305 - 389 nm 苯环结构；> 400 nm C=O 结构1 二苯乙烯苷类 320 nm.2 色谱柱的选择及其保留特性的比较在前期研究中，制备了一种苯基与四唑基键合在二氧化硅上的环氧四氮唑料，与常规 C18 材料具有不同的选择性与保留特性。在此基础上，本研究环氧四氮唑与 Unitary C18 材料装填的色谱柱，对巴天酸模的乙酸乙酯提取析，结果见图 2。

色谱图,巴天酸模,一维,色谱图

和 C18 键合色谱填料制作的不同色谱柱来构建离线二维色谱分离体系。为了方便后续的制备，采用了甲醇和水（含 0.1%甲酸）作为流动相优化分离条件，流动相体系简单，没有盐的引入，避免了脱盐处理。图 2a 色谱图峰形简单，峰的重叠现象少，在上样量较大的一维制备中峰之间重合的可能性低，因此，选用环氧四氮唑作为一维色谱分离材料。第二维色谱分析需要色谱柱具有更好的分离效果，而图 2b 色谱图峰间距小，峰多且杂，选择 Unitary C18作为二维色谱的分析柱，能够得到更多的样品信息。2.3 巴天酸模乙酸乙酯萃取液的一维色谱分离在构建反相/反相二维色谱系统中，选择环氧四氮唑作为一维分离色谱柱。在上样量大的情况下，一些含量低的成分峰在制备谱图中比较明显，因此，实际接取组分的数量与分析谱图中峰的数量存在差异。按色谱峰接取流分，得到 18 个组分，分别为F1～F18(见图 3)。

HPLC色谱,混合标准,色谱柱

石油醚和氯仿萃取的成分相似；通过与混合标准品的色谱图（图6）的保留时间以及紫外吸收值对比，发现这两个萃取部位的出峰情况与混合标准品的色谱图相似，表明其包含的主要成分可能是常见的几个游离蒽醌类成分。而正丁醇部位保留了巴天酸模提取液大部分的中等极性成分（见图 5d），并且一部分复杂的峰在 400 nm以上也有紫外吸收，而这是蒽醌类成分的紫外吸收特征。水层中可能保留一些没有紫外吸收的单糖和寡糖类成分，需要通过其他途径进一步分析（见图 5e)。鉴于正丁醇层中涵盖了乙醇提取液的大部分未知的蒽醌及蒽醌苷类组分，而且萃取的目标物含量高，因此，选择对正丁醇层进行进一步分离分析。

【参考文献】