PEPT1对朱砂在Caco-2细胞模型中转运的影响
发布时间：2020-08-31 14:00
目的:基于Caco-2细胞模型研究PEPT1对朱砂跨膜吸收的介导作用,进一步阐明朱砂的吸收机制。方法:1.建立UPLC-ICP/MS分析方法检测给药后Caco-2细胞模型中刷状缘侧(AP侧),细胞内和基底侧(BL侧)的无机汞含量。2.建立Caco-2细胞模型,并通过细胞形态学,跨膜电阻值及荧光素渗透率来评价Caco-2细胞单层膜的完整性。3.建模成功后,设置空白对照组、朱砂组、硫化汞组和氯化汞组进行以下实验。(1)考察朱砂、硫化汞和氯化汞在Caco-2细胞模型中的转运水平:分别将0.2μM的朱砂,硫化汞和氯化汞与Caco-2细胞孵育6 h,收集含药培养基后加入新的含药培养基,共计4次,末次给药6 h后,用UPLC-ICP/MS检测4次收集的AP、BL侧培养基及细胞内无机汞含量。(2)PEPT1的基因及蛋白表达:将上述细胞样本经前处理后,采用RT-PCR和Western-blot法检测PEPT1在基因和蛋白水平上的变化。(3)抑制PEPT1对朱砂、硫化汞和氯化汞转运的影响:分别采用siRNA沉默和化学抑制法抑制Caco-2细胞中PEPT1的活性,然后考察朱砂、硫化汞和氯化汞在Caco-2细胞模型中的转运水平。结果:1.建立了灵敏、高效、快速的UPLC-ICP/MS检测方法,可满足对样本中无机汞含量检测的要求。2.Caco-2细胞单层模型具有良好的紧密性和完整性,其跨膜电阻值大于500Ω.cm~2且荧光素渗透率小于1×10~(-6) cm/s,表明本实验建立的Caco-2细胞单层模型可用于朱砂、硫化汞和氯化汞的转运研究。3.给予朱砂、硫化汞和氯化汞后,在AP侧,朱砂、硫化汞和氯化汞中的无机汞含量分别约占总汞(总添加量)的97.71%,97.72%,97.56%;在细胞内,朱砂、硫化汞和氯化汞中的无机汞含量分别约占总汞的1.95%,1.81%,1.77%;在BL侧,朱砂、硫化汞和氯化汞中的无机汞含量分别约占总汞的0.34%,0.47%,0.68%。朱砂组和硫化汞组中的无机汞的含量为氯化汞组的49.39%和30.41%。4.与对照组相比,朱砂和硫化汞显著降低Caco-2细胞中PEPT1 mRNA的表达水平,朱砂显著降低了PEPT1蛋白的表达水平,硫化汞也可下调PEPT1蛋白的表达水平,但差异无统计学意义。5.朱砂,硫化汞或氯化汞与PEPT1-siRNA转染细胞孵育后,与对照组相比,朱砂中的无机汞在细胞内含量减少了30.03%,在BL侧含量减少了57.85%。硫化汞中无机汞含量在AP侧,细胞内及BL侧均无明显差异。氯化汞中的无机汞在BL侧的含量增加了34.48%。6.给予布洛芬后,与对照组相比,朱砂中的无机汞在BL侧的含量减少了33.32%。而硫化汞和氯化汞中的无机汞的转运在AP侧,细胞内及BL侧均无明显差异。结论:(1)朱砂、硫化汞的肠道转运水平低于氯化汞;(2)PEPT1介导了朱砂在Caco-2细胞模型中的转运。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：
图 1 药物在 Caco-2 细胞单层膜吸收实验示意图Fig. 1 Schematic diagram of transport of drug across Caco-2 cell monolayers.3.5 总 RNA 提取及 RT-PCR 测定取培养至 21 天左右的细胞，吸弃培养基，用 37℃HBSS 液轻柔的清洗细胞层 3 次以去除细胞表面上的杂质，最后一次将含 37℃HBSS 液的细胞置于 CO2箱中孵育 30min。弃去 AP 侧和 BL 侧的 HBSS 液，将细胞与含朱砂（0.2μM）、化汞（0.2 μM）或氯化汞（0.2 μM）的完全培养基温孵 24 h，其中以 6、12、8、24 h 的时间点从 AP 侧取出 100 μL 全部药液，并立即向其中加入相同体积新鲜的含朱砂，硫化汞或氯化汞的完全培养基以替换取样结果损失的体积。24 后用事先预冷的 D-hanks 快速清洗细胞表面 3 次并加入 200 μL Trizol，根据AKARA 公司提供的说明提取总的 RNA。利用 ND-2000 超微量分光光度计测NA 浓度，比率在 1.8＜ OD260/OD280＜ 2.1 范围内表示 RNA 纯度符合要求。用逆转录试剂盒进行逆转录，引物用 primer3 软件设计并列出。15 μL 的 PCR
遵义医科大学硕士学位论文 吴青2 结果2.1 Caco-2 细胞模型建立2.1.1 细胞形态学检查[34]用倒置显微镜观察细胞形态，由图 2 表明培养 21 天的 Caco-2 细胞已形成致密的单层膜且细胞形态良好，可清楚的观察到细胞间界限。图 A 为培养瓶里的Caco-2 细胞，图 B 为 Caco-2 细胞在 Transwell 板里生长到 21 天的状态。
图 3 Caco-2 细胞单层模型跨膜电阻值Fig. 3 Transepithelial electrical resistances value of Caco-2 cell monolayers.3 荧光素渗透率Caco-2 细胞单层模型通透性的验证通常都是通过测定胞旁或跨膜转运Papp来判断的[36]。我们选择了荧光素为细胞旁转运标志物，结果显示荧光的 Papp在参考范围之类，即小于 1×10-6cm/s，表明细胞单层渗透率正 4。表 4 荧光素的表观渗透系数Table. 4 Pappof the markers of transcellular transport标志物Papp/1×10-6cm/s参考值/1×10-6cm/s荧光素 0.11±0.04 <1
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：
图 1 药物在 Caco-2 细胞单层膜吸收实验示意图Fig. 1 Schematic diagram of transport of drug across Caco-2 cell monolayers.3.5 总 RNA 提取及 RT-PCR 测定取培养至 21 天左右的细胞，吸弃培养基，用 37℃HBSS 液轻柔的清洗细胞层 3 次以去除细胞表面上的杂质，最后一次将含 37℃HBSS 液的细胞置于 CO2箱中孵育 30min。弃去 AP 侧和 BL 侧的 HBSS 液，将细胞与含朱砂（0.2μM）、化汞（0.2 μM）或氯化汞（0.2 μM）的完全培养基温孵 24 h，其中以 6、12、8、24 h 的时间点从 AP 侧取出 100 μL 全部药液，并立即向其中加入相同体积新鲜的含朱砂，硫化汞或氯化汞的完全培养基以替换取样结果损失的体积。24 后用事先预冷的 D-hanks 快速清洗细胞表面 3 次并加入 200 μL Trizol，根据AKARA 公司提供的说明提取总的 RNA。利用 ND-2000 超微量分光光度计测NA 浓度，比率在 1.8＜ OD260/OD280＜ 2.1 范围内表示 RNA 纯度符合要求。用逆转录试剂盒进行逆转录，引物用 primer3 软件设计并列出。15 μL 的 PCR
遵义医科大学硕士学位论文 吴青2 结果2.1 Caco-2 细胞模型建立2.1.1 细胞形态学检查[34]用倒置显微镜观察细胞形态，由图 2 表明培养 21 天的 Caco-2 细胞已形成致密的单层膜且细胞形态良好，可清楚的观察到细胞间界限。图 A 为培养瓶里的Caco-2 细胞，图 B 为 Caco-2 细胞在 Transwell 板里生长到 21 天的状态。
图 3 Caco-2 细胞单层模型跨膜电阻值Fig. 3 Transepithelial electrical resistances value of Caco-2 cell monolayers.3 荧光素渗透率Caco-2 细胞单层模型通透性的验证通常都是通过测定胞旁或跨膜转运Papp来判断的[36]。我们选择了荧光素为细胞旁转运标志物，结果显示荧光的 Papp在参考范围之类，即小于 1×10-6cm/s，表明细胞单层渗透率正 4。表 4 荧光素的表观渗透系数Table. 4 Pappof the markers of transcellular transport标志物Papp/1×10-6cm/s参考值/1×10-6cm/s荧光素 0.11±0.04 <1
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本文编号：2808901
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