山柰酚诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和周期阻滞作用的研究

发布时间：2020-08-31 21:33

　　研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是指以滑膜关节中的慢性炎症为特征的,慢性和系统性自身免疫性疾病。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)在软骨破坏中发挥重要作用。激活的RA FLSs与肿瘤细胞具有多种生物学特性,并通过积极增殖和抗凋亡而在血管翳形成中发挥重要作用,最终导致关节骨和软骨的破坏。因此,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在RA中发挥治疗作用。断藤益母汤是导师治疗RA系列经验方之一,在临床抗RA治疗中有确切疗效,但其物质基础尚未阐明。课题组前期已采用UFLC-Q-TOF-MS/MS技术结合血清药物化学方法分析断藤益母汤的活性成分,初步筛选出山柰酚(Kaempferol)为可能活性成分之一。山柰酚是一种黄酮类化合物,既往研究表明其具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种药理学作用,但对于诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞作用的研究,至今国内外尚未见报道。由于山柰酚对于肿瘤、骨关节炎以及其抗菌活性及其涉及的调节机制与炎症及免疫调节密切相关,因此本研究推测:山柰酚对RA异常生物学行为也具有调控作用。为此,该论文选择断藤益母汤中抗炎活性成分较好的山柰酚进行深入研究,分别在类风湿关节炎细胞模型和动物模型上系统的考察了药物的疗效,并从分子水平上阐明了药物作用的机制,确定了药物作用的靶点,这不仅为山柰酚治疗RA提供理论支持和实验依据,还将为断藤益母汤的“多成分—多靶点—多途径”整合机制研究,为其临床应用,为中药复方研究的现代化提供科学依据,为研发RA创新药物奠定基础。一、山柰酚诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和周期阻滞作用的研究目的:1.培养和鉴定RA FLSs。2.研究山柰酚对RA FLSs生长形态、生存率及增殖率的影响3.研究山柰酚诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞的作用。方法:收集符合美国ACR 1987年RA诊断标准的9例患者,通过膝关节镜下滑膜切除术或膝关节置换手术后取得其滑膜组织,采用组织块培养法进一步分离培养成滑膜成纤维细胞(RA FLSs)。采用光学显微镜观察体外分离培养的细胞形态。采用细胞免疫荧光法对FLS中特异表达的vimentin蛋白进行鉴定。用不同浓度的山柰酚处理细胞后,采用CCK-8法检测山柰酚对RA FLSs细胞生存率的影响,倒置显微镜下观察细胞形态变化,采用EdU法检测细胞增殖率,采用流式细胞术检测细胞的凋亡率及周期阻滞情况。结果:光学显微镜下观察体外分离培养的原代细胞,组织贴壁后5-7天可见细长型细胞从组织边缘爬出,逐渐增多呈放射状。3～4周后渐覆盖瓶底70%～80%。3代后细胞类型逐渐纯化,细胞呈长梭型,胞核卵圆形居中,形态与FLSs相符。采用细胞免疫荧光实验显示细胞表达vimentin高表达,根据以上结果,本研究认为本研究培养的细胞为RA FLSs。CCK-8实验结果显示:使用25μM、50μM、100μM、200μM山柰酚和20μMMTX处理RA FLSs 24h,细胞活力下降。和空白对照组比较,山柰酚组(100μM、200μM)和MTX组RA FLSs的细胞活力显著下降(P0.05或P0.01),故后续应用100μM、200μM的山柰酚和20μM MTX干预RA FLSs研究。EdU法实验结果显示:经过100μM、200μM的山柰酚和20μMMTX干预后,RA FLSs增殖率相对于空白对照组显著下降(P0.05或P0.01),且呈浓度依赖性,提示山柰酚和MTX可抑制RA FLSs的增殖。凋亡检测结果显示:与空白对照组比较,山柰酚组和MTX组凋亡率增加(P0.05或P0.01),提示山柰酚和MTX可诱导RA FLSs发生凋亡。细胞周期检测结果显示:与空白对照组比较,山柰酚组和MTX组的G0/G1期细胞比例上升(P0.05或P0.01),S期的细胞比例无显著变化(P0.05),而G2/M期细胞比例显著下降(P0.05或P0.01)。其中,在山柰酚200μM高剂量干预组中,G0/G1期的细胞增加约34%和G2/M期的细胞减少约32%。提示山柰酚和MTX可诱导G0/G1期的RA FLSs生长阻滞。结论:山柰酚抑制类风湿关节炎纤维细胞样滑膜细胞的增殖,诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞。因此,山柰酚可能具有治疗RA的治疗潜力。二、山柰酚诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和周期阻滞的分子机制研究目的:研究山柰酚诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞的分子信号机制。方法:取培养至3-5代并经过鉴定的RA FLSs进行实验。采用免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4表达水平和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9表达水平以及,以及PI3K、Akt及其磷酸化水平。免疫印迹法检测PI3K抑制剂(LY294002)对RA FLSs周期相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响。流式细胞术检测PI3K抑制剂(LY294002)对细胞凋亡和周期阻滞的影响。结果:免疫印迹法显示,山柰酚干预组中,凋亡相关蛋白Bcl-2及PI3K和Akt蛋白磷酸化表达水平明显降低(P0.05或P0.01),Bax、Cleaved Caspase 3和Cleaved Caspase 9表达水平上升(P0.05或P0.01)。PI3K蛋白抑制剂(LY294002)干扰后增强了山柰酚对RA FLSs的作用:与山柰酚组比较,LY294002联合山柰酚组细胞活力和凋亡率均下降;Bcl-2及Akt蛋白磷酸化表达水平明显降低(P0.05),Bax、CleavedCaspase3和Cleaved Caspase 9表达水平上升(P0.05)。免疫印迹法显示,山柰酚干预组中,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin dependent kinase,CDK4)表达水平下降(P0.05或P0.01)。PI3K蛋白抑制剂(LY294002)干扰后增强了山柰酚对RA FLSs的作用:与山柰酚组比较,LY294002联合山柰酚组或者G0/G 1期的细胞比例上升,而G2/M期的细胞比例显著下降(P0.05);Cyclin D1和CDK4表达水平均下降(P0.05)。结论:山柰酚可以通过PI3K/Akt信号通路诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞。三、山奈酚对小鼠胶原诱导性关节炎的治疗作用目的:观察山柰酚对CIA小鼠关节炎模型的治疗作用。方法:48只SPF级DBA/1雄性小鼠,7-8周龄,实验分组:模型组,山柰酚(高、中、低剂量)组,甲氨蝶呤组(MTX)。以正常小鼠作为正常对照组,以MTX为阳性对照。每组样本量为8只。应用经典的RA模型—胶原诱导性关节炎(CIA)模型,实验各组在RA小鼠模型第二次免疫时即在造模第21天开始给予相应的处理,山柰酚(高、中、低剂量)组,分别给予山柰酚200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg,每天灌胃1次,连续28天。甲氨蝶吟(MTX)组,参照文献方法,给予2mg/Kg,每3天灌胃1次,连续9次。模型组和正常对照组给予等体积溶媒,每天灌胃1次,连续28天。每4天观察检测小鼠一般情况,并进行小鼠关节炎评分。检测指标:计算脾指数、踩关节采用HE染色观察其病理变化和采用荧光Tunel法检测滑膜细胞的凋亡情况、ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达量。结果:动态评估小鼠关节炎严重程度:与模型组比较,给药9天后山柰酚高剂量组小鼠关节炎得分显著下降(P0.05或P0.01),给药13天后山柰酚中剂量组和MTX组小鼠关节炎得分亦明显下降(P0.05),山柰酚低剂量组小鼠关节炎得分虽有下降趋势,但无统计学意义(P0.05)。脾指数:与正常组比较,模型组小鼠脾指数有升高趋势(P0.01),与模型组比较,各治疗组小鼠脾指数有下降趋势,且山柰酚高剂量和MTX组具有统计学意义(P0.05)。实验各组小鼠血清炎症因子改变:造模后,模型组较正常组IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显上升(P0.05或P0.01)。与模型组比较,各治疗组IL-1β、IL-6、TNF-α表达降低,山柰酚高、中剂量组和MTX组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低具有统计学差异(P0.05或P0.01)。实验各组小鼠踝关节HE染色病理学:模型组滑膜细胞增生显著、排列杂乱,大量炎性细胞浸润,关节软骨和骨质破坏;各治疗组小鼠关节滑膜增生减轻,炎性细胞浸润减少,骨质破坏范围缩小,部分关节结构有所修复。与模型组比较,各治疗组小鼠病理学评分有下降趋势,山柰酚高、中剂量组和MTX组病理学评分显著下降具有统计学差异(P0.05)。实验各组小鼠踝关节TUNEL染色病理学:与模型组比较,各治疗组小鼠滑膜细胞凋亡率有上升趋势,山柰酚高、中剂量组和MTX组滑膜细胞凋亡率显著上升具有统计学差异(P0.05或P0.01)结论:山柰酚能有效缓解CIA小鼠关节炎症状,抑制滑膜炎症、关节软骨及骨质破坏。山柰酚对RA的滑膜炎症以及随后的关节破坏均有一定的治疗作用。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

光学显微镜,非正态性,细长型,细胞类型

Ｖ阳，ＰＩ阳和蛋Ｖ胞的百分比。逡逑学分析逡逑数据用ＳＰＳＳ２０．０统计软件处理，定量资料用均数土标准差土ｓ）比较用ｔ检验，多个样本均数比较采用Ｏｎｅ邋—Ｗａｙ邋ＡＮ０ＶＡ分析，两两比果数据为非正态性分布，采用Ｋｒｕｓｋａｌ邋—邋Ｗａｌｌｉｓ秩和检验。／＜０．邋０５意义。逡逑邋ＦＬＳｓ的培养和鉴定逡逑显微镜下观察，组织贴壁后５－７ｄ可见细长型细胞从组织边缘爬出，逐（图１Ａ）。３？４周后渐覆盖瓶底７０％？８０％。３代后细胞类型逐渐纯型，胞核卵圆形居中，形态与ＦＬＳｓ相符（图１Ｂ）。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ是ＦＬＳ中蛋白，采用细胞免疫荧光实验显示细胞表达ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋Ｃ图１Ｃ），根据宄认为本研宄培养的细胞为ＲＡ邋ＦＬＳｓ。逡逑

山柰酚,活力

ＣＣＫ－８实验研宄山柰酚和ＭＴＸ对ＲＡＦＬＳｓ细胞活力的确定本实验中山柰酚和ＭＴＸ的实验浓度。ＣＣＫ－８实验ｌＯＯｐＭ、２００ｐＭ山柰酚和２０｜ｉＭ邋ＭＴＸ处理ＲＡＦＬＳｓ２４ｈ，较，山柰酚组（１００｜＿ｉＭ、２０Ｃ＾Ｍ）和ＭＴＸ组ＲＡＦＬＳｓ尸＜０．０１）（表２，图２）；山柰酚组（２００｜＿ｉＭ）和ＭＴ山柰酚和ＭＴＸ可抑制ＲＡＦＬＳｓ的活力，且与药物浓度显，差异有统计学意义，故后续应用ｌ0（ＶＭ、２Ｃ％Ｍ的Ｓｓ做后续实验研宄。逡逑表２山柰酚对ＲＡ邋ＦＬＳｓ活力的影响（Ｉ邋土ｓ）逡逑组别逦Ｎ逦２４小时抑制率（％）逡逑空白组逦３逦１００．７０邋＋邋７．邋０２逡逑山柰酚组（２５１４１）逦３逦９２．４７±１２．１０逡逑山柰酚组（５０ＭＭ）逦３逦８３．６６±１２．邋１０逡逑山柰酚组（１００蝴）逦３逦７４．６６±９．０８＊逡逑山柰酚组（２００刚）逦３逦４９．８９±９．５（Ｔ逡逑ＭＴＸ组（２０ＭＭ）逦３逦７０．邋６７±５．邋４５＊逡逑与空白组比较，‘Ｋ0＿邋０５，＊＊／＂＜０．邋０１；与ＭＴＸ组比较，△代０．０５１２０－１逡逑

山柰酚,凋亡

逡逑ＦＬＳｓ的增殖（表３，图３和４）。逡逑Ｋａｃｍｐｆｃｒｏｌ（ｆｉＭ）逡逑Ｃ邋ｔｒｌ逦１００逦２００邋Ｍ邋ｒＸ（２０ｊ＾Ｍ）逡逑■ＭＢ逡逑■ＩＢ逡逑图３山柰酚对ＲＡ邋ＦＬＳｓ增殖的影响（Ｘ２００）逡逑表３山柰酚对ＲＡ邋ＦＬＳｓ增殖的影响（Ｉ邋土ｓ）逡逑＾邋组别逦Ｎ逦增殖率逡逑空白组逦３逦４９．邋１６±８．８９逡逑山柰酚组（１００ＭＭ）逦３逦２８．邋４８±８．邋０６＊逡逑山柰酚组（２００刚）逦３逦１４．邋８６邋±７．邋５５＊＊逡逑１ＭＴ）（组（２０ＭＭ）逦３邋２ｆｉ．邋３４±５．８７＊逡逑注：与空白组比较，＊Ｋ0．邋０５，邋＊＊尸＜０．邋０１。逡逑６０－逡逑．邋｜Ｅ邋娭邋＿逡逑ｓ邋叫邋＿邋＿邋＿邋＿逡逑Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ邋（ｊｉＭ邋）邋－逦１００逦２００逦－逡逑ＭＴＸ邋（ＭＭ邋）逦２０逡逑图４山柰酚对ＲＡ邋ＦＬＳｓ增殖的影响Ｇ邋土邋ｓ）逡逑（四）山柰酚对ＲＡ邋ＦＬＳｓ凋亡的影响逡逑为了调查山柰酚是否有影响对ＲＡＦＬＳｓ的凋亡，本研究使用了ＡｎｎｅｘｉｎＶＶ－ＦＩＴＣ邋／逡逑ＰＩ双染色以评估百分比的变化凋亡细胞。结果显示，山柰酚和ＭＴＸ组均引起了显著的逡逑影响ＲＡＦＬＳｓ凋亡增加，呈剂量依赖性方式。与空白对照组比较，山柰酚和ＭＴＸ可显著逡逑诱导ＲＡＦＬＳｓ发生凋亡（ＰＣ０．０５或尸＜０．０１），山柰酚组（２００＾Ｍ）和ＭＴＸ组之间比较具逡逑有统计学差异，提示山柰酚和ＭＴＸ可诱导ＲＡＦＬＳｓ发生凋亡（表４，图５和６）。逡逑２６逡逑

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