葛根素协同5-FU抗结肠癌的药效机制研究

发布时间：2020-09-04 19:19

　　 结肠癌为常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,其发病率在国内外近几年的报道中也呈现明显上升趋势。5-氟尿嘧啶(5-FU)单用或联合用药至今仍用于胃肠道恶性肿瘤的一线治疗。但因具有天然的耐药性,患者易对其产生耐药而使总体有效率降低。葛根素是葛根的主要有效成分,现代药理研究表明葛根素可以通过抑制DNA的合成,抑制cox-2基因表达等作用表现其抗癌作用,对人的胆管癌QBC939细胞,胰腺癌PANC-1细胞,肺癌H446细胞等多种癌细胞均有明显的生长抑制和促凋亡作用。此外,葛根素与其他化疗药合用可表现协同作用,提高肿瘤细胞的凋亡率。化疗药物的耐药性多与外排蛋白表达有关,因此从外排蛋白的角度阐述机理具有较大研究意义。药物转运蛋白是影响药物吸收和分布的一类跨膜转运蛋白,其在肠道细胞中分布广泛。其中P-gp能主动泵出进入肿瘤细胞内的化疗药物使肿瘤细胞内抗癌药物蓄积减少,其过度表达是肿瘤的多药耐药性的重要机制之一。目前发现的可以逆转多药耐药现象的化药中,大多毒性强、成本高,限制了临床应用。中药单体成分作为化疗增敏剂具有一定的潜力。为探寻葛根素能否增加化疗药物对肿瘤细胞的杀伤率及其可能的作用机制,结合前期葛根芩连方的研究结果,拟通过比较经典化疗药五氟尿嘧啶单独给药与葛根素和五氟尿嘧啶联合给药对人结肠腺癌上皮细胞Caco-2的抑制作用和对实体瘤的抑制率。并以P-gp为研究对象,进一步从蛋白功能和能量角度探寻其可能的作用机制。1.药效研究稳定培养了人结肠癌Caco-2细胞,细胞生长及传代良好。利用MTT法测定葛根素与5-FU单独用药和联合用药对Caco-2细胞抑制率的影响。将葛根素与5-FU联合用药,与单用相比,可明显降低Caco-2细胞的存活率。单独用药时,葛根素对Caco-2细胞的IC50为3404.53 μM,5-FU对Caco-2细胞的IC50为190.64μM,联合用药时,葛根素和5-FU对Caco-2细胞的IC50为别为1475.06μM和92.19μM,证明葛根素与5-FU联合使用能协同增加对Caco-2细胞的抑制作用。通过Hoechst 33258和流式细胞术比较联合用药与单独给药对Caco-2细胞凋亡和周期的影响。Hoechst 33258染色后,加药组与对照组相比,葛根素对Caco-2细胞无明显的促凋亡作用,5-FU对Caco-2细胞有显著的促凋亡作用,联合用药组的细胞凋亡率与5-FU组相比无明显差异,证明葛根素与5-FU联用对Caco-2细胞的无明显协同促凋亡作用。并且在流式结果中也得到证实。在周期检测中,与空白对照组相比,葛根素组能显著提高GO/G1期细胞的比例(P0.001),并降低S期细胞的比例(P0.05)。单独用药组与联合用药组相比,GO/G1期细胞的比例具有显著性差异(P0.001),证明葛根素能将细胞周期阻滞于GO/G1期,并能协同5-FU阻滞细胞周期,从而抑制癌细胞的增长。5-FU单用与葛根素和5-FU合用组可以显著性抑制裸鼠皮下瘤的生长,葛根素虽在统计学上无显著性差异,但葛根素组平均肿瘤体积是对照组的0.59倍,平均瘤重是对照组的0.57倍,肿瘤的体积和肿瘤重量的均值均比对照组小,分析可能由于样本数量较少,肿瘤在体内的增长组内差异较大,影响了统计学差异。2.机制研究研究葛根素对Caco-2MDR1基因与P-gp表达量的影响,从蛋白基因表达的角度阐述其对P-gp的影响。通过q-pcr检测的结果来看,与空白组相比将葛根素单独给药和与5-FU联合用药,可以显著性的降低P-gp MDR1基因表达量。研究葛根素对P-gp ATP酶活性以及细胞内ATP含量的影响,从能量依赖的角度阐述其对P-gp外排功能的影响。根据发出光的强度与ATP的浓度成正比的原理。通过标准曲线用化学发光荧光分光光度计来检测发光值,计算ATP含量,表明当葛根素与5-FU联合用药时可以显著性的降低细胞内ATP含量。通过比较经P-gp ATP酶选择性抑制剂Na3V04进行处理和未经处理样品间的信号差异,测试化合物对P-gp ATP酶活性的影响,表明当葛根素与5-FU联合用药时可以显著性的降低细胞内ATP酶活性,从而抑制蛋白。通过Docking分析,以P-gp为药物靶点,比较葛根素与P-gp天然配体结合能力比较ATP与葛根素对蛋白的结合能力,通过计算机对接出的结果可以看到,葛根素与P-gp的得分为6.435,而ATP与P-gp的结合活性为5.700。葛根素的Docking Score数值更大,说明葛根素与P-gp的结合活性大于ATP与P-gp的结合活性,更容易与蛋白结合。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5

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本文编号：2812472