青蒿琥酯对溶酶体功能的影响及其在抑制肿瘤细胞耐药性中的意义

发布时间：2020-09-05 11:25

　　目的:研究青蒿琥酯抑制肿瘤细胞增殖的作用与对溶酶体功能的影响,探讨溶酶体抑制在增强耐药细胞药敏性中的意义。方法:通过CCK8法检测细胞活力,观察青蒿琥酯对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用;通过Western blot法检测溶酶体组织蛋白酶cathepsin D和cathepsin L以及凋亡相关蛋白PARP和caspase3的变化;透射电子显微镜观察青蒿琥酯对线粒体的影响,同时观察自噬/溶酶体相关变化;JC-1检测线粒体膜电位以及检测细胞色素c在线粒体及胞浆的水平来评价青蒿琥酯对线粒体功能的影响;采用GFP-RFP-LC3Ⅱ稳转细胞株,评价青蒿琥酯对自噬流的影响。LysoTracker和LysoSensor标记溶酶体并检验溶酶体的改变;通过敲减或过表达溶酶体生物合成相关的转录因子TFEB,观察溶酶体功能对肿瘤细胞耐药性的影响;用三种耐药细胞株评价青蒿琥酯对肿瘤细胞耐药性的影响。结果:细胞增殖实验结果显示,青蒿琥酯可以明显抑制多种肿瘤细胞增殖,并且具有浓度依赖性;JC-1结果、线粒体内外细胞色素c水平检测结果以及透射电镜结果分别显示,青蒿琥酯处理后线粒体膜电位显著降低、细胞色素c从线粒体释放至胞浆增多,空泡化线粒体明显增多;此外,青蒿琥酯处理后PARP以及caspase3蛋白水平升高,提示青蒿琥酯损伤了线粒体并且引起细胞凋亡。在检测自噬/溶酶体功能中发现,电镜结果显示青蒿琥酯处理后自噬体数量增多,而自噬溶酶体数量减少;GFP-RFP-LC3Ⅱ稳转细胞株也显示出同样的结果。结果提示青蒿琥酯可能抑制了溶酶体功能。进一步检测溶酶体功能发现,青蒿琥酯使溶酶体组织蛋白酶cathepsin D、cathepsin L的激活型降低,酶活降低,LysoTracker和LysoSensor实验结果显示青蒿琥酯升高了溶酶体pH,抑制了溶酶体活性。TFEB过表达与敲减实验证明,高溶酶体活性细胞具有较强的耐药性,而青蒿琥酯通过抑制溶酶体功能,可逆转耐药细胞的增殖。在青蒿琥酯对耐药细胞的影响实验中发现,三种耐药细胞中具有最高cathepsins活性的细胞是耐紫杉醇的A549细胞,而青蒿琥酯对这种细胞的生长抑制作用最强。结论:青蒿琥酯可以抑制溶酶体功能,减少失能线粒体的清除,从而引发细胞凋亡。青蒿琥酯通过抑制溶酶体功能明显增强了耐药细胞对药物的敏感性,且对组织蛋白酶表达高的耐药细胞抑制效果更明显。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285

【参考文献】