仙茅多糖葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶酶解产物的研究

发布时间：2020-09-07 11:29

　　仙茅多糖具有较好的增强免疫、抗氧化、抗疲劳等生物活性,具有很高的药用价值和经济价值。本实验探讨了酶法提取仙茅粗多糖的分离纯化工艺,得到了纯多糖XMPS-1,测定了XMPS-1的纯度和分子量。分别运用葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶对XMPS-1进行分子修饰,考察了XMPS-1的两种酶解工艺,并使用凝胶层析柱对酶解产物进行分离、薄层色谱法对酶解产物进行分析,通过体外细胞实验对葡聚糖酶酶解产物进行了活性研究,为寻找仙茅多糖激活巨噬细胞的功能活性中心片段奠定基础。主要结果如下:1、在单因素考察的基础上,采用Design-expert 8.0.5b软件和响应面法对纤维素酶提取仙茅多糖的工艺进行优化,得到最优的工艺条件为:酶添加量1.3%、酶解温度58℃、酶解时间110 min和pH 5.7时,仙茅多糖提取率达到最大值,为20.52%,分别比超声提取法和热水浸提法所得粗多糖增多了129.8%和54.9%。通过DEAE纤维素柱和Sephadex G-50凝胶柱对粗多糖进行分离纯化得到纯级分XMPS-1,凝胶柱层析检测结果和高效凝胶色谱法结果都显示XMPS-1具有较高的纯度,所以可认为XMPS-1是分子量分布均一多糖。经高效凝胶色谱法检测,XMPS-1相对分子质量为3031 Da。2、考察了酶添加量、温度、时间和pH对XMPS-1葡聚糖酶酶解产物的影响,在单因素基础上,使用响应面法优化酶解工艺。模型P0.0001,失拟项P=0.34330.05,表明模型拟合程度较好,方法具有设计意义。最佳酶解条件为:酶添加量56%,温度52℃,酶解时间12 h,pH 6.0,此时还原糖生成量可达0.2019mg/mL,经实验验证,所测值与期望值差值在5%以内,较吻合,可信度较高。对酶解产物通过Sephadex G-25凝胶柱分离、薄层分析,酶解时间为7~9 h的3批酶解产物显示有较纯酶解产物片段生成。3、以还原糖的生成量为检测指标,运用响应面-星点设计法构建了有关β-半乳糖苷酶的各酶解因素对XMPS-1酶解工艺影响的模型。酶添加量、酶解时间的适当增加以及适宜的pH值和温度都能增加还原糖的生成,各因素对还原糖生成量的影响强弱为:时间酶添加量温度pH值;最佳优化条件为酶添加量10000 U/g,温度46℃,酶解时间10 h,pH 6.6。通过Sephadex G-25凝胶柱分离、薄层分析,酶解2.5,5.0,7.5和10.0 h的4批酶解产物经透析后分别得到了较纯的酶解产物片段。4、将葡聚糖酶酶解XMPS-1得到的12批酶解产物进行活性分析,经过MTT实验发现,样品浓度500μg/mL以下,孵育时间48 h以内,药品对细胞没有明显的毒害作用;且多数样品的细胞存活率高于100%,说明多数XMPS-1的酶解产物不仅对细胞无毒害,还对细胞的生长具有一定的促进作用。通过ELISA测试试剂盒和Griess法检测加入药液后巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-1和NO的含量,综合各酶解产物对三种细胞因子的作用效果,可以得出,大多数酶解产物对三种细胞因子的分泌都有较好的促进作用,尤以酶解5 h的酶解产物最为突出,其在不同孵育时间和不同的样品浓度下对三种细胞因子的分泌都有较好的促进作用,具有深入研究价值。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284.2

【参考文献】