苔类植物黄酮氧甲基转移酶和糖基转移酶功能研究

发布时间：2020-09-07 12:52

　　 苔类植物是最早的陆生植物群,为了适应干旱的陆地环境,体内产生了丰富的次级代谢产物(包括联苄、萜类、木脂素类、香豆素和黄酮类等化合物)。黄酮类化合物具有重要的生理活性,在植物应对生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用。该类化合物在母核形成之后可发生多种修饰反应包括甲基化、糖基化和酰基化等,因此种类繁多。黄酮是苔类植物中常见的成分,不同类别的黄酮已被分离鉴定,其中包含甲基化和糖基化的黄酮。黄酮甲基化反应由植物氧甲基转移酶(O-methyltransferases,OMTs)参与催化,将S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)提供的甲基基团转移到黄酮羟基上。OMTs 一般分为两类:Class Ⅰ OMTs 和 Class Ⅱ OMTs。Class Ⅰ OMTs也称为咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(Caffeoyl CoA O-methyltransferases,CCoAOMTs),分子量一般在23-29 KDa,酶活反应需要Mg2+的参与,特异性催化脂酰辅酶A,其亚类CCoAOMT-like可催化香豆素和黄酮等多种化合物。ClassⅡOMTs分子量较大,且不需要金属离子参与催化,该类酶称为咖啡酸氧甲基转移酶(Caffeic　acid　O-methyltransferases,COMTs),催化底物包括咖啡酸、香豆素、生物碱和各种黄酮等化合物。本文从钝鳞紫背苔(Plagiochasma　appendiculatu 的转录组测序数据库筛选出四个注释为COMT的基因,分别命名为PaF4'OMT,PaCOMT2,PaCOMT3和PaCOMT4。经序列比对发现,PaF4'OMT比来自其他植物的COMTs长约27个氨基酸。将蛋白长的N端截掉并命名为PaCOMT1-Tr。进化分析表明,四个目的基因都属于Class Ⅱ OMTs,位于黄酮氧甲基转移酶的根部。从植物中克隆出目的基因全长,构建到蛋白表达载体上,经IPTG诱导蛋白表达后用Ni柱分离纯化蛋白。酶活结果显示,PaF4'OMT可以催化一系列黄酮生成B环对位羟基甲基化产物,而不能催化苯丙素类化合物。其最适底物是芹菜素,可被催化生成金合欢素。PaCOMT1-Tr也具有催化活性,但反应效率和底物选择性低于PaF4'OMT,说明在植物体内真正起作用的是PaF4'OMT。PaCOMT2-4不具有催化活性。金合欢素是一种重要的化合物,具有多种药用价值,通过芹菜素甲基化的方式生成金合欢素,构建了含有PaF4'OMT的工程菌株,利用工程菌株发酵的方法获得该化合物。这是第一次从苔类植物中鉴定出二类氧甲基转移酶。实验室前期从粗裂地钱(Marchantia paleacea)和钝鳞紫背苔中克隆并鉴定了两个氧甲基转移酶,分别为MpOMT和PaF6OMT。序列比对和进化树分析结果表明它们属于Class ⅠOMTs,但与经典OMTs序列相似性低,在进化关系上与动物儿茶酚氧甲基转移酶聚为一簇。为了研究该类基因是否在苔类植物中普遍存在以及在进化过程中的关系,用MpOMT序列搜索楔瓣地钱(Marchantia emarginata)和圆叶裸蒴苔(Haplomitrium mnioides)的转录组数据库,找到两个CCoAOMTs并分别命名为MeOMT和HmOMT。这两个基因在进化地位上与MpOMT和PaF60MT 一致。MeOMT、HmOMT和MpOMT具有相似的催化特性,可反应多种底物,催化效率高,最适底物是秦皮乙素,而PaF60MT主要催化黄芩素和野黄芩素C-6位羟基的甲基化。MeOMT、HmOMT、MpOMT和PaF60MT具有很高的序列相似性,但是催化特点不同。为了研究与底物催化有关的关键氨基酸,对MpOMT和PaF60MT进行了点突变,发现PaF60MT中第59位的精氨酸有利于黄芩素和野黄芩素的C-6位羟基的甲基化。底物饲喂实验表明基因在载体上的连接位置、底物浓度等均可影响产物的产量,并提出一种新的生产千层纸素A和东莨菪内酯的方法。黄酮苷类化合物由糖基转移酶(Uridine diphosphate glycosyltransferases,UGTs)催化生成,糖基转移酶将UDP活化的糖基供体转移到黄酮类化合物形成糖苷。黄酮的糖基化有利于化合物转运和代谢。为了研究苔类植物中UGTs的催化特点和功能,本文从钝鳞紫背苔的转录组数据库中筛选出三个注释为UGT的基因,分别命名为PaUGT1、PaUGT2和PaUGT3。经序列比对发现,PaUGTs序列与其他植物的UGTs差异较大,但C端的PSPG序列相似性高,关键氨基酸保守。进化树分析表明三个基因同属于一簇,和其他植物黄酮7-O-GTs属于同一进化枝。将三个基因从钝鳞紫背苔中克隆出来,构建入原核表达载体,并用UDP-葡萄糖作为糖基供体进行了体外酶活反应,结果显示PaUGT1是黄酮7位糖基转移酶,催化芹菜素、木樨草素、槲皮素和山奈酚四种底物生成黄酮7-O-葡萄糖苷。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284
【部分图文】：

０．５逡逑图２．２邋ＰａＣＯＭＴｓ系统发生进化树分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰａＣＯＭＴｓ．逡逑Ｔｈｅ邋ｓｃａｌｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ邋ｄｉｓｔａｎｃｅ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｒｅ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓ，邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋１，０００邋ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．邋ＩＯＭＴ，邋ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；邋ＤＯＭＴ

图２．４邋ＰａＦ４＇ＯＭＴ对不同底物的相对催化活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋ＰａＦ４’ＯＭＴ邋ｔｏｗａｒｄｓ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．（见实逡逑验记录邋０００３３８５邋Ｐ６７）逡逑

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本文编号：2813369