怀山药多糖分离纯化、抗衰老活性及其对Klotho基因的表达调控研究

发布时间：2020-09-09 08:35

　　怀山药是著名的四大怀药之一,多糖为怀山药的重要活性成分,具有诸多药理方面的作用,现已成为怀山药化学成分与功能性成分的研究热点。然而,目前关于怀山药多糖抗衰老的研究大多只集中于生物学活性的检测上,对其作用的分子机理方面相关研究,特别是怀山药多糖对抗衰老基因的表达调控研究还没有引起足够的重视。本研究以怀山药为研究对象,采用水提醇沉法分离和纯化多糖,通过体内和体外的抗衰老实验,系统地研究怀山药多糖在抗衰老方面的活性及其对抗衰老基因Klotho的表达调控作用,为阐明怀山药的抗衰延寿作用提供科学依据。本文的主要研究内容包括以下四个部分:1.怀山药多糖的提取和分离:采用水提醇沉法提取怀山药多糖,Sevage法去除蛋白,透析法纯化,又用SDS-PAGE、Molish反应及红外光谱法进行鉴定,结果表明提取物为怀山药多糖,苯酚-硫酸法测定其多糖含量为91.77%。2.怀山药多糖的体外抗衰老活性:采用CCK-8法和β-半乳糖苷酶染色法检测怀山药多糖对NRK-52E细胞和TCMK-1细胞的影响,结果表明怀山药多糖对两种正常细胞无抑制作用;而对于H_2O_2所造成的细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用,说明怀山药多糖具有显著的抗衰老活性。3.怀山药多糖的体内抗衰老活性:采用D-半乳糖诱导小鼠建立衰老动物模型,口服给予不同剂量的怀山药多糖,考察怀山药多糖的体内抗衰老活性,结果表明,怀山药多糖能明显改善小鼠的学习记忆能力和空间识别能力,且存在明显的量-效关系,同时海马组织病理切片显示,怀山药多糖能明显改善衰老小鼠海马组织中神经元细胞的退化、变形现象,修复衰老小鼠海马组织中神经元细胞的损伤。此外,怀山药多糖亦能明显改善衰老小鼠肝、肾组织器官的病理状态,使肝、肾的储备能力得到修复,从而改善衰老小鼠体内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的生理指标,具有明显的抗衰老活性。4.怀山药多糖对Klotho基因的表达调控研究:提取小鼠脑、肾组织中的总RNA,并反转录成cDNA;然后采用PCR及实时荧光定量PCR法检测小鼠脑、肾脏组织中抗衰老基因Klotho的表达水平,结果表明怀山药多糖能明显增加小鼠脑、肾脏组织中Klotho基因的表达量进而起到抗衰老的作用。综合上述结果表明,怀山药多糖具有明显的抗衰老活性,是一种值得深入研究的新型药物和功能性食品,其抗衰老的机制可能是通过清除体内自由基,有效改善机体的生理状态,使各组织器官的功能得到修复。在此基础上,通过调节体内抗衰老基因Klotho的表达水平来共同实现其抗衰老作用,这一结果更进一步为中医认为的“肾虚致衰学说”和西医认为的“遗传程序学说”提供了实验基础和科学依据。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285;R284
【部分图文】：

人口数,老年人口,人口老龄化,机体

1.1.1 衰老及其现状长期以来衰老都是一个备受关注的话题，不同领域包括医药及美容行业都有着与之密不可分的联系。衰老的特征在于机体的生理功能逐渐减弱，各个器官受损并最终导致机体死亡。同时随着衰老的发生，机体也会产生诸多病变，包括癌症、糖尿病、心血管相关疾病和神经退行性疾病等[1]。人类的老龄化与预计的寿命之间呈现出正相关的关系，而人口老龄化则意味着老年人口数量的增加、老年人口比例以及老年疾病比例的上升，因此人口老龄化为衰老科学提出了更高更紧迫的要求及任务[2]。据统计，我国的老年人口所占比例由 1980 年的 3%增长到 2010 年的 13%[3]。根据 2019 年 2 月国家统计局发布的《2018 年国民经济和社会发展统计公报》，如表 1.1 所示，我国的总人口为 13.95 亿，其中 60 岁以上人口已达 17.9%，65 岁以上人口也已经高达 11.9%。显然，老年人口所占的比例呈逐年上升的趋势。据专家预测，到 2050 年，老龄化人口数目将达至我国总人口的 20%左右，可见老年人口占据比例更加巨大，人口老龄化形势更加严峻，因而也会引发更多的社会问题[3-5]。

学科分布,抗衰老

图 1.2 “抗衰老”的学科分布中医理论与衰老理论认为人从诞生至死亡，必然要经历出生、成长、强壮、生命阶段，衰老是随着年龄的增长，生命精华物质不断亏损和形体生理结构逐渐衰退的现象[6]。古代书籍中不乏对于衰老帝内经太素卷之三阴阳》写道“若人能修道察同，去损益之

蛋白质,多糖,紫外-可见分光光度法,葡萄糖

准确称取 5 mg 怀山药多糖粉末，超纯水定容至 50 mL。从中取 1 mL 溶液置于具塞试管中，按照以上方法测得样品吸光度，通过得出的葡萄糖浓度标准曲线方程，计算怀山药多糖的含量。2.4 结果与讨论2.4.1 怀山药多糖纯化及鉴定结果通过分别对去除蛋白质前后的多糖进行 SDS-PAGE 电泳来检测多糖中的蛋白是否被去除，结果如图 2.1A 所示，未去除蛋白之前怀山药中的蛋白质只有一种，其分子量为 35 kDa。而采用 Sevage 法去除蛋白质后的多糖，从图 2.1A 第 3泳道可以看出蛋白条带几乎消失，表明怀山药多糖中的蛋白质已经被去除。图2.1B 为去除蛋白质后紫外扫描全波长的结果图，280 nm 为蛋白质在紫外下的最大特征吸收波长，从图中可见该处没有明显的紫外吸收峰，此结果与侯宇等[55]报道的实验结果类似，即说明怀山药多糖中蛋白质已经去除。图 2.1C 为 Molish反应[56]结果，图中可以分别看出怀山药多糖和葡萄糖两个试管中的两个液面之间均有一紫色环，表明此方法提取的物质为多糖成分。

【相似文献】