栝楼抗肿瘤活性蛋白对大肠癌细胞上皮间充质转化和迁移的影响及机制研究

发布时间：2020-09-09 10:04

　　大肠癌(Colorectal cancer,CRC)也叫结直肠癌,是一类由多因素引起的消化道恶性肿瘤。大多数结肠癌可以通过检测和去除癌前结肠腺瘤来预防。同样,通过在早期阶段检测结肠癌,可以通过手术切除治愈疾病,从而预测可观的益处。目前,医治大肠癌的方法主要是化疗。但是,在诊治大肠癌时,部分化疗药品会给人体带来不同程度的毒副作用,它们在杀死癌细胞的同时,也有可能杀死正常细胞。除此之外,由于它的毒副作用会引起另外一类疾病。研究表明,植物来源的抗肿瘤活性蛋白作用机制独特,抵抗癌症的效果明显,是一种值得研究的抗肿瘤药物。栝楼(Trichosanthes kirilowii)是葫芦科的一种藤本植物。栝楼中含有多种生物活性的成分。我们课题组之前已从栝楼的果实中发现一种抗肿瘤活性蛋白TKP,实验研究表明,它可以显著的诱导大肠癌细胞的凋亡,说明它具有良好的抗肿瘤潜能。本文拟研究TKP对大肠癌细胞上皮间充质转化和迁移的影响及机制。主要研究内容包括以下几部分:第一部分:栝楼抗肿瘤活性蛋白TKP对大肠癌细胞上皮间充质转化的影响。分别采用终浓度为0、0.1、0.25和0.5μg/mL的TKP处理大肠癌细胞DLD1和HCT11624 h后,首先观察细胞形状的变化;采用qRT-RCR检测细胞中EMT关键蛋白的表达;通过相关试验检测细胞与基质间的粘附能力;再通过MTT方法检测TKP对细胞存活的影响。形态观察结果表明,TKP的处理可以改变细胞的形态,对照组细胞大多长梭形,具有多个触角,呈现出间质细胞的特点。经TKP处理以后,细胞的触角减少,形态呈圆形,呈现出上皮细胞的特点。TKP处理大肠癌细胞24 h后,随着TKP浓度的增加,细胞内钙黏着蛋白E-cadherin表达上调,N-cadherin和波形蛋白Vimentin表达下调。粘附实验表明,TKP的处理导致了细胞与基质间的粘附能力降低。MTT结果表明这些浓度TKP的处理对细胞存活没有明显影响。因此,这些结果表明TKP处理抑制大肠癌细胞发生EMT。第二部分:TKP通过PKM2调节STAT3/Snail1信号通路从而抑制大肠癌细胞上皮间充质转化。分别采用终浓度为0、0.1、0.25和0.5μg/mL的TKP处理大肠癌细胞DLD1和HCT116 24 h后,采用western检测细胞内STAT3和p-STAT3的蛋白水平。结果表明TKP处理减少大肠癌细胞中STAT3和p-STAT3的蛋白水平,同时核内的p-STAT3水平和Snail1 mRNA表达水平也降低。这些结果表明TKP处理导致STAT3/Snail1信号通路被抑制。此外,TKP处理降低PKM2的表达和其核转位。为了进一步研究PKM2在STAT3/Sanil1信号通路介导EMT抑制过程中的作用,利用转染技术过表达PKM2。实验结果表明过表达PKM2后逆转了TKP诱导的p-STAT3下调,并且TKP抑制的细胞上皮间充质转化被明显逆转。以上结果表明TKP能通过调控PKM2调节STAT3/Sanil1信号通路从而抑制大肠癌细胞发生EMT。第三部分:TKP通过Wnt/β-catenin信号通路来抑制大肠癌细胞的迁移。分别采用终浓度为0、0.1、0.25和0.5μg/mL的TKP处理大肠癌细胞DLD1和HCT116 24 h后,通过伤口愈合实验来检测细胞的迁移情况,结果表明,大肠癌细胞经过TKP处理,其迁移能力下降。Western印迹结果表明细胞内的β-catenin和p-GSK3β蛋白表达水平下调,而且与细胞迁移相关的基因MMP7和MMP9的mRNA表达水平也下降。在加入Wnt通路的激活剂LiCl后,由TKP处理诱导的细胞迁移下降得到逆转,此外,细胞内β-catenin和p-GSK3β蛋白水平也得到逆转。总之,以上结果表明TKP通过Wnt/β-catenin信号通路抑制了大肠癌细胞的迁移。综上所述,TKP通过调控PKM2抑制STAT3/Snail1信号通路,从而改变EMT关键因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达,最终抑制大肠癌细胞发生EMT。此外,TKP能通过调控Wnt/β-catenin通路抑制大肠癌细胞迁移。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

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图 1.1 细胞 EMT 过程 EMT 的分子基础EMT 是一个动态的细胞行为，与多种生长因子、蛋白质分子、转录因子以调控的途径密切相关[18,19]。转化生长因子-β ( transforminggrowth factor-β，TGF-β) 是调节 EMT 进程的

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栝楼果实抗肿瘤活性蛋白TKP的纯化

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图 2.2 TKP 处理改变人肠癌细胞 DLD1 和 HCT116 的形态变化KP 处理抑制人肠癌细胞 DLD1 和 HCT116 的上皮间充质转化为了检测 TKP 处理对 DLD1 和 HCT116 细胞 EMT 的影响，采用终浓度25和0.5 μg/mL的TKP处理细胞24 h后，分别检测细胞内E-cadherin、N-c

【参考文献】