肾虚骨质疏松与EPO的相关性及右归饮的改善作用

发布时间：2020-09-14 13:05

　　背景中西医对于“肾主骨”的认识既有区别也有联系。西医发现肾脏功能部分或全部丧失时,机体的骨代谢会发生紊乱,出现骨质疏松、骨硬化等症状。中医基础理论认为“肾主骨”,“肾精”可以滋养骨骼。促红细胞生成素EPO(erythropoietin,EPO),具有促进造血、脑保护等多种作用,为本课题组提出的“肾精”的生物物质基础的假设物质之一。肾虚骨质疏松小鼠的EPO含量如何变化,外源性EPO和传统补肾益精方药右归饮对肾虚骨质疏松模型有无改善作用及其与EPO的相关性,目前尚未见报道。研究这一问题对于揭示补肾益精方药的生物学作用机制具有重要意义。本研究得到了国家自然科学基金面上项目(81473549)和教育部中央高校基本科研业务费项目(XDJK2017D158)的支持。目的观察肾虚骨质疏松与EPO的相关性,及右归饮的改善作用;验证“EPO为‘肾精’的物质基础之一”的假设,寻找“肾精”的生物学物质基础。方法1.肾虚骨质疏松小鼠模型的构建及模型成功的判定标准(1)肾虚骨质疏松小鼠模型:C57BL/6J小鼠,雄性,体重24±2 g,饲喂0.2%腺嘌呤模型饲料5周,自由摄食饮水,每周测量体重和体温,造模结束后测定其它指标。(2)模型成功的判定标准:每只小鼠的体重、体温、睾酮(testosterone,T)、皮质醇(cortisol,CORT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨密度和骨小梁数量显著低于正常组小鼠均值(均P0.05);肌酐(creatinine,CREA)、尿素氮(BUN)、钙(calcium,Ca)和磷(phosphorus,P)显著高于正常组小鼠均值(均P0.05)。(3)模型成功率:试验显示上述造模方法模型成功率达80%—90%,稳定可行。2.试验动物分组、组间均衡性检验及给药(1)外源性EPO对肾虚骨质疏松小鼠的试验:在上述方法造模2周时,根据随机数表法将造模小鼠分为模型组、EPO5000 U·kg~(-1)组,每组15只。经统计各造模组小鼠体温、体重、肾功能、内分泌、骨代谢和骨显微参数,结果显示无显著性差异(均P0.05)后,方进行后续试验。继续饲喂0.2%的腺嘌呤饲料,EPO组皮下注射5000 U·kg~(-1)的EPO,正常组和模型组皮下注射等体积的生理盐水,每周3次,3周后结束。(2)右归饮对肾虚骨质疏松小鼠的试验:在上述方法造模2周时,根据随机数表法将造模小鼠分为模型组、右归饮10、20和40 g·kg~(-1)组,每组20只。经统计各造模组小鼠体温、体重、肾功能、内分泌、骨代谢和骨显微参数,结果显示无显著性差异(均P0.05)后,方进行后续试验。继续饲喂0.2%的腺嘌呤饲料,右归饮组灌胃相应剂量右归饮,正常组和模型组灌胃相应体积的生理盐水,每天1次,3周后结束给药。3.肾虚骨质疏松小鼠的改善指标及其测定方法(1)外观形态:观察每组小鼠的蜷缩弓背状态和毛发的颜色,每周测量各组小鼠体重和体温。(2)肾的形态学:观察各组小鼠肾脏大体形态学,肾脏行石蜡切片制作HE染色观察其组织形态学。(3)肾功能指标:心脏取血,离心取血清,用全自动血液生化仪测定CREA和UREA含量。(4)内分泌指标:用酶联免疫法测定血清中CORT和T的含量。(5)骨形态学指标:股骨脱钙后,行石蜡切片制作HE染色观察其组织形态学。(6)骨功能学指标:小动物显微CT测定股骨的骨密度和显微参数指标。(7)骨代谢指标:用全自动血液生化仪测血清中Ca、P和ALP的含量。4.血清及骨EPO含量和信号通路蛋白测定方法(1)血清中EPO含量的测定:用酶联免疫法检测血清中EPO的含量;(2)股骨中HIF-EPO信号通路蛋白测定:股骨组织匀浆后,用蛋白免疫印迹法测定HIF-1α、HIF-2α、EPO和EPOR的表达。分析比较各指标间差异性。5.试验用右归饮的质量控制方法及结果(1)右归饮指纹图谱的建立(1)采用高效液相色谱建立右归饮指纹图谱。测定条件:采用Pursuit XRs 5 C_(18)色谱柱(4.6mm×250 mm,5μm)进行分离,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脱,1%A→10%A(0~30 min)、10%A→17%A(30~80 min)、17%A→30%A(80~105min)、30%A→55%A(105~125 min);流速1.0 mL·min~(-1);检测波长230 nm;柱温30℃;进样量10μL。(2)本试验对所用右归饮建立HPLC指纹图谱,其中10批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.904。(2)右归饮中主要成分含量测定(1)采用高效液相色谱测定右归饮中主要成分京尼平苷酸、莫诺苷、绿原酸、栀子苷、马钱苷、松脂醇二葡萄糖苷、甘草苷、芦丁和甘草酸的含量。测定条件:采用Pursuit XRs 5 C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)进行分离,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脱,1%A→10%A(0~30 min)、10%A→17%A(30~80min)、17%A→30%A(80~105 min)、30%A→55%A(105~125 min);流速1.0mL·min~(-1);检测波长230 nm;柱温30℃;进样量10μL。(2)本试验建立的HPLC色谱条件专属性、线性关系、精密度、稳定性、重复性和加样回收率良好。测得右归饮中9种主要成分的含量均满足2015版药典的要求。结果1.肾虚骨质疏松小鼠血清及骨中EPO的含量降低造模5周后,与正常组相比,模型组小鼠血清中EPO和股骨中的HIF-1α、HIF-2α、EPO含量显著降低,EPOR含量显著升高(均P0.05)。2.外源性EPO能显著改善肾虚骨质疏松小鼠体质给药3周后,与模型相相比,EPO组小鼠具有以下改善:(1)外观形态:EPO组小鼠毛发的光泽、蜷缩拱背得到了改善;体重和体温显著性升高(均P0.05)。(2)肾形态学指标:EPO组小鼠的“大白肾”症状得到改善。EPO组肾单位的数量明显增加,肾小体和肾小管的形态明显改善,紫蓝色腺嘌呤结晶明显减少。(3)肾功能指标:EPO组小鼠血清中CREA和UREA含量显著降低(均P0.05)。(4)内分泌指标:EPO组小鼠血清中T和CORT含量显著升高(均P0.05)。(5)骨形态学指标:EPO组明显增加骨小梁的数量,骨小梁的连接中断点也明显减少。(6)骨功能学指标:EPO组的骨密度和骨小梁数量显著增加(均P0.05),骨质疏松的症状得到明显减轻。(7)骨代谢指标:EPO组小鼠的血清中的Ca的含量显著减少(均P0.05)。3.外源性EPO能显著升高股骨中HIF-1α、HIF-2α、EPO含量,降低EPOR含量给药3周后,与模型组相比,EPO组小鼠股骨中的HIF-1α、HIF-2α、EPO含量显著升高,EPOR含量显著降低(均P0.05)。4.右归饮能显著改善肾虚骨质疏松小鼠体质给药3周后,(1)外观形态:与模型相相比,右归饮20和40 g·kg~(-1)组小鼠的毛发光泽,蜷缩拱背得到了明显改善;体重和体温显著性升高(均P0.05)。(2)肾的形态学:右归饮10 g·kg~(-1)组、20 g·kg~(-1)组、40 g·kg~(-1)组小鼠的“大白肾”症状得到改善。右归饮20 g·kg~(-1)组、40 g·kg~(-1)组肾单位的数量明显增加,肾小体和肾小管的形态明显改善,紫蓝色腺嘌呤结晶明显减少。(3)肾功能指标:右归饮20 g·kg~(-1)组、40 g·kg~(-1)组小鼠血清中CREA和UREA含量显著降低(均P0.05)。(4)内分泌指标:右归饮20 g·kg~(-1)组、40 g·kg~(-1)组小鼠血清中T含量显著降低(均P0.05)。(5)骨形态学指标:右归饮20 g·kg~(-1)组、40 g·kg~(-1)组明显增加骨小梁的数量,骨小梁的连接中断点也明显减少。(6)骨功能学指标:右归饮20 g·kg~(-1)组、40 g·kg~(-1)组的骨密度和骨小梁数量显著增加(均P0.05),骨质疏松的症状得到明显减轻。(7)骨代谢指标:右归饮20 g·kg~(-1)组、40 g·kg~(-1)组小鼠的血清中的Ca、Mg和P的含量显著减少(均P0.05)。5.右归饮能显著升高肾虚骨质疏松小鼠血液及骨中EPO含量并调节EPO信号通路给药3周后,(1)血清中EPO含量:与模型组相比,右归饮10 g·kg~(-1)组、20 g·kg~(-1)组小鼠血清中EPO含量显著升高;(2)股骨中HIF-EPO信号通路观察:右归饮10 g·kg~(-1)组、20 g·kg~(-1)组小鼠股骨中的HIF-1α、HIF-2α、EPO含量显著升高,EPOR含量显著降低(均P0.05)。结论1.采用雄性C57/B6L小鼠,以0.2%腺嘌呤饲料饲喂5周后,能成功构建肾虚骨质疏松模型。该模型不仅具有常规肾虚指标和骨质疏松指标,且模型小鼠血清中EPO和股骨中EPO,及其信号通路相关蛋白HIF-1α、HIF-2α的含量均显著下降,EPOR的含量均显著升高。2.外源性EPO可显著改善肾虚骨质疏松小鼠的体质。其机制可能与升高血清中EPO和股骨中EPO、HIF-1α、HIF-2α的含量,降低EPOR含量的表达,调节HIF-EPO信号通路中相关蛋白的表达有关。3.右归饮可显著改善肾虚骨质疏松小鼠的体质。其机制可能与升高血清中EPO和股骨中EPO、HIF-1α、HIF-2α的含量,降低EPOR含量的表达,调节HIF-EPO信号通路中相关蛋白的表达有关。试验用右归饮质量控制指纹图谱及9种成分的含量测定为试验结果的可信性、可重复性提供了基本保障。4.肾虚骨质疏松与可能EPO含量下降有显著相关性,外源性EPO能显著改善肾虚及其骨质疏松。双补肾阴肾阳并且养血生精的右归饮显著改善肾虚骨质疏松的同时能显著升高EPO含量。上述结果支持“EPO可能为‘肾精’的生物学物质基础之一”的假说。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

小鼠模型,肾虚,信号通路,腺嘌呤

图 1-1 EPO-JAK2 信号通路Figure 1-1 The signaling pathway of EPO-JAK2故本章采用腺嘌呤饲料饲喂 C57BL/6J 小鼠构建肾虚骨质疏松小鼠模型，并用免疫法观察模型小鼠血清中EPO的含量和western blot法观察股骨中HIF-EPO通路相关蛋白的变化。

外观形态,小鼠,小动物,统计软件

照说明书测定血清中 T 和 CORT 的含量度及显微参数的测定-20℃冰箱的右侧股骨，用小动物显微 CT 测定股骨的理采用 IBM SPSS Statistics 20 统计软件进行分析，以 ±散程度。组间数据比较采用单因素方差分析，以 P＜0模型的检验，与正常组相比，模型组小鼠反应迟钝、弓背蜷缩、去光泽，见图 1-2。

体重,模型小鼠,体温变化,体温

西南大学硕士学位论文表 1-1 造模 2 周模型小鼠的体重和体温Table 1-1 The weight and temperature of mice in 2 weeks after modeling组别第 0 周第 1 周第 2 周体重（g）体温（℃）体重（g）体温（℃）体重（g）体温（℃）正常组 20.03±1.53 37.12±0.41 20.63±2.11 37.04±0.53 22.10±1.81 36.78±0.89模型组 20.70±1.32 37.27±0.34 18.26±1.28 37.27±0.34 15.16±1.18##33.17±1.01##注：与正常组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。n=10， ±SD。Note:Versus control group,#P＜0.05，##P＜0.01。n=10， ±SD。

【参考文献】