远志HMGR、CHS基因的克隆与表达研究

发布时间：2020-09-15 10:07

　　 目的:克隆远志3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因与查尔酮合成酶(CHS)基因,分析其基因表达量对药用成分含量的影响,并从酶活性的角度验证HMGR的功能,为远志资源的可持续利用及种质改良提供借鉴。方法:(1)通过RT-PCR与RACE相结合的方法克隆远志HMGR、CHS基因的全长序列,并对其进行生物信息学分析,同时对HMGR、CHS基因编码的蛋白功能与结构进行预测与分析。(2)利用RT-qPCR技术、紫外分光光度法、高效液相色谱法分别测定了远志根、茎、叶不同部位HMGR基因及CHS基因表达量、远志总皂苷及总黄酮含量、细叶远志皂苷及远志口山酮Ⅲ含量,并对基因表达量与药用成分进行相关分析。(3)通过气相色谱质谱联用法对HMGR的功能进行验证。结果:(1)从远志中克隆获得HMGR、CHS基因的全序列,并分别命名为PtHMGR、PtCHS,(GenBank登录号分别为MK424118、MK424117)。PtHMGR cDNA序列为全长2323 bp,包含一个1782 bp的完整开放阅读框,共编码593个氨基酸;预测PtHMGR编码蛋白的理化性质,其分子式为C_(2781)H_(4486)N_(770)O_(853)S_(33),分子量为63414.84 Da,等电点PI为6.09。PtCHS cDNA序列为全长1634 bp,包含一个537 bp的完整开放阅读框,共编码178个氨基酸;预测PtCHS编码蛋白的理化性质,其分子式为C_(895)H_(1420)N_(244)O_(251)S_(12),分子量为19999.33 Da,等电点PI为9.25。(2)远志PtHMGR、PtCHS基因在根、茎、叶不同部位之间差异表达,其中PtHMGR基因在根部表达量最高,叶次之,茎部表达较低;PtCHS基因在茎部表达量最高,叶次之,根部最少。远志根、茎、叶不同部位总皂苷、总黄酮、细叶远志皂苷、远志口山酮Ⅲ的含量也存在差异,其中总皂苷、细叶远志皂苷、远志口山酮Ⅲ在根部含量较高,而总黄酮主要积累于茎部。远志PtHMGR、PtCHS基因表达量与药用成分相关分析显示,总皂苷及细叶远志皂苷含量与PtHMGR基因的表达呈正相关;总黄酮含量与PtCHS基因表达呈正相关,而远志口山酮Ⅲ含量与PtCHS基因表达量呈负相关。(3)HMGR经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后成功表达,并催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲瓦龙酸内酯。结论:本研究首次从远志中克隆获得HMGR、CHS基因的全序列,并分析了远志PtHMGR、PtCHS基因与药用成分的关联性,结果显示总皂苷及细叶远志皂苷含量与PtHMGR基因的表达量正相关;总黄酮含量与PtCHS基因表量正相关。利用气相色谱质谱联用法对PtHMGR的功能进行验证,结果显示,远志PtHMGR具有HMGR酶的催化功能,可催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲瓦龙酸内酯。因此可通过上调基因的表达来促进远志药效成分的积累,进而提高远志药材的质量。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：

28S 和 18S 条带清晰（图1）无明显拖尾现象，说明 RNA 完整性较好[23]。OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标，RNA 的 OD260/OD280读数一般在 2.0 左右，2.0 是高质量 RNA的标志。通过超微量分光光度计检测远志总 RNA 的 OD260/OD280比值为 1.94，说明 RNA 中蛋白质污染程度较低，纯度较高，因此提取的远志根部总 RNA 可用于后续 cDNA 第一链的合成。图 1 远志总 RNA 电泳图Fig.1 Total RNAelectropherogram of P. tenuifolia3.2 远志 HMGR、CHS 基因核心片段序列的获取将远志总 RNA 反转录为 cDNA，以 cDNA 第一链为模板，分别利用引物HMGR-F1、HMGR-R1 和 CHS-F1、CHS-R1

2 远志 HMGR(a)、CHS(b)基因核心片段电泳图 (Mhe electropherogram of intermediate fragments of HMGRMGR、CHS 基因 5′RACE 实验得的远志 HMGR、CHS 基因核心片段设计三条特异性1 、 HMGR-GSP2 、 HMGR-GSP3 和 CHS-GSP1 、利用引物HMGR-GSP1和CHS-GSP1将远志总RNA反模板，利用引物HMGR-GSP2、HMGR-GSP3和CHS-GCR 扩增后，得到大小分别约为 500 bp、1000 bp 的两

MGR(a)、CHS(b)基因 5'RACE 电泳图 (M： electrophoretogram of HMGR and CHS genes (、CHS 基因 5'片段长度分别为 456 bp、942 bCHS 基因 3'RACE 实验CHS 基因核心片段序列结果，设计两条特异和CHS-1、CHS-2。将远志总RNA反转录为3'，利用两条引物进行两轮 PCR 扩增后，得到 的条带，如图 4 所示。得到的远志 HMGR、p、464 bp。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 邹建华;远志根中的蔗糖衍生物[J];国外医学(中医中药分册);1994年04期

2 ;远志根提取物对小鼠星形胶质细胞分泌肿瘤坏死因子的影响[J];国外医药(植物药分册);1999年03期

3 司德昭;陈鹭声;;远志的引种研究[J];中草药;1984年10期

4 韩晗;张智华;曹秋实;吕银娟;;远志的药用分析[J];中医药导报;2018年24期

5 滕红梅;蔡霞;胡正海;;远志根的结构发育与远志皂苷积累关系的研究(英文)[J];植物研究;2014年05期

6 滕红梅;李金亭;胡正海;;远志根的发育解剖学研究[J];西北植物学报;2008年01期

7 高玲玲;刘文哲;;远志根的形态发生及组织化学研究[J];热带亚热带植物学报;2008年01期

8 刁家葳;王幼鹏;张学兰;李慧芬;吴鹏;栾茹乔;徐保鑫;宋梦晗;;远志不同炮制品中3种寡糖酯类成分含量比较[J];辽宁中医杂志;2018年02期

9 滕红梅;房敏峰;胡正海;;2种远志根结构及其皂苷含量的比较研究[J];西北植物学报;2008年12期

10 裴瑾,万德光,杨林;苯酚-硫酸比色法测定远志及地上部分多糖的含量[J];华西药学杂志;2005年04期

相关会议论文 前5条

1 滕红梅;胡正海;;远志根的结构发育与远志皂苷积累关系的研究[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编（1933-2008）[C];2008年

2 李亚岭;张炳勇;张延瑞;韩双印;;远志根提取物对小鼠TNBS肠炎治疗效果的观察[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（下册）[C];2007年

3 张炳勇;李亚岭;张延瑞;韩双印;;远志根提取物对TNBS诱导的小鼠结肠炎治疗机理的研究[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（下册）[C];2007年

4 杨敬芝;李建北;李创军;张东明;;远志的化学成分研究[A];第七届全国天然有机化学学术研讨会论文集[C];2008年

5 孟艳;张学兰;唐玉秋;李慧芬;;远志炮制前后5种寡糖酯类成分的变化规律[A];2014年全国中药炮制学术年会暨中药饮片创新发展论坛及协同创新联盟会议会议讲义[C];2014年

相关重要报纸文章 前4条

1 记者 白毅;远志根提取物具有抗痴呆作用[N];中国医药报;2009年

2 ;远志市场前景好 人工种植效益高[N];中国中医药报;2005年

3 记者 李天舒;远志根提取物有抗痴呆作用[N];健康报;2009年

4 侯丽丽 王仲琴;科学采收 提质增效[N];山西科技报;2003年

相关博士学位论文 前3条

1 黄立华;基于药代动力学研究厚朴缓解远志毒副作用的机制[D];成都中医药大学;2015年

2 王光志;远志资源与品质评价研究[D];成都中医药大学;2006年

3 房敏峰;远志资源生态化学评价及道地性分析[D];西北大学;2015年

相关硕士学位论文 前9条

1 马晓芳;远志HMGR、CHS基因的克隆与表达研究[D];宁夏医科大学;2019年

2 范玲玲;远志鲨烯环氧酶基因克隆及其转录组研究[D];宁夏医科大学;2018年

3 徐芮;基于谱效关系的远志质量评价研究[D];宁夏医科大学;2018年

4 彭艳群;栽培远志质量形成限制因子研究[D];宁夏医科大学;2017年

5 黄艳杰;丽江远志化学成分及其生物活性研究[D];西南林业大学;2017年

6 王丹丹;远志药材的传统辨状论质与现代品质评价的相关研究[D];山西大学;2017年

7 李亚岭;远志根提取物对小鼠实验性肠炎作用及其机制的研究[D];郑州大学;2007年

8 高玲玲;远志的解剖学、组织化学及皂苷类化合物积累规律的研究[D];西北大学;2008年

9 乔艳花;基于核磁共振数据的非负矩阵分解算法[D];山西大学;2013年

本文编号：2818828