丹酚酸B防治人乳头瘤病毒感染及其机制研究

发布时间：2020-09-16 21:09

　　 研究背景:宫颈癌(Cervical cancer,CC)是目前最常见的妇科恶性肿瘤之一,其已经成为15至44岁女性癌症死亡的第二大主要病因。流行病学研究表明,99.7%的宫颈癌患者均伴有高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染。人乳头瘤病毒是嗜上皮性DNA病毒,在众多的HPV亚型中,约40种能感染生殖道粘膜,其中高危型HPV-16和18型感染导致了 70%以上的宫颈癌的发生,低危型HPV如HPV-6、11等则主要引起感染部位的低度病变、生殖器或皮肤疣和尖锐湿疣。高危型HPV病毒的持续性感染是导致细胞发生癌变的重要条件。通常,病毒感染会导致细胞分泌大量炎症因子,从而导致慢性炎症的发生。而慢性炎症在在肿瘤形成过程中发挥着重要的作用,癌相关炎症因子的高表达能促进肿瘤的侵袭,从而促进肿瘤远处转移和血管生成。随着肿瘤的生长,其内部供氧不充分,该缺氧环境导致肿瘤细胞生成更多新生血管,以补给供氧。同时,癌相关炎症因子通过激活多种信号通路,促进肿瘤血管生成,加快肿瘤生长和转移。中药单体丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)是丹参主要的水溶性组分之一,在众多丹参的酚酸提取物中含量最为丰富,且具有多种生物学活性,其被报道具有抗炎、抗氧化、调节凋亡、抑制血小板聚集、改善冠状微循环等作用。我们前期研究发现,丹酚酸B能有效抑制三株HPV假病毒株感染靶细胞,本研究深入探讨了丹酚酸B发挥抗HPV病毒的作用机制。另外,由于丹酚酸B本身具有较好的抗炎活性,本研究进一步探讨了丹酚酸B对HPV感染后细胞炎症因子表达和肿瘤细胞血管生成的影响。本文研究的丹酚酸B来源广泛、价格低廉、水溶性高、毒副作用小,且具有高效抗HPV及抗炎活性,因此极有可能被开发成为一类新的安全高效的双功能抗HPV杀微生物剂用于防治HPV感染,减少宫颈癌的发生。研究方法:1.体外假病毒体系评估丹酚酸B抗HPV病毒效果,Time-of-addition、流式细胞术、Temperature shift、表面等离子共振等方法检测丹酚酸B发挥抗病毒作用的可能作用机制和靶点;2.荧光定量PCR、酶联免疫吸附(ELISA)法检测丹酚酸B对HPV感染诱发的炎症因子表达的影响;3.荧光定量PCR、酶联免疫吸附(ELISA)、Western blotting法检测丹酚酸B对氯化钴诱导的宫颈癌细胞HIF-1α、VEGF蛋白及其调节通路的影响;4.MTT法检测丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞的毒性作用;通过病理切片、ELISA及免疫组化法检测丹酚酸B凝胶对家兔阴道粘膜的刺激性。研究结果:1.丹酚酸B能剂量依赖性地抑制HPV病毒感染靶细胞,其主要抑制病毒进入靶细胞的早期阶段,能与病毒的主要衣壳蛋白L1特异性结合,进而抑制HPV病毒颗粒黏附于靶细胞表面;2.丹酚酸B能剂量依赖性地下调HPV感染HeLa细胞后炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的表达,降低IL-6、IL-8蛋白的表达;3.丹酚酸B能剂量依赖性地下调氯化钴诱导的宫颈癌Siha细胞HIF-1α及下游VEGF蛋白的表达,其通过影响PI3K/AKT和ERK1/2通路抑制HIF-1α蛋白的合成;4.丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞基本无毒,其CC50均大于800μg/ml。家兔阴道刺激性实验结果显示,丹酚酸B凝胶对家兔阴道上皮无损伤,对阴道粘膜炎症因子的释放无明显影响,不会引起的阴道上皮细胞和基质细胞的异常增殖。研究结论:丹酚酸B能抑制HPV病毒感染靶细胞的早期阶段,其直接靶向病毒L1蛋白,阻止病毒黏附入侵靶细胞,进而发挥抗病毒作用。此外,丹酚酸B能够有效抑制HPV感染所诱发的炎症反应和肿瘤细胞血管生成。丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞基本无毒,不会诱导家兔阴道粘膜炎症反应,安全性较高,因此极有可能被开发成为一类安全高效的多功能抗HPV杀微生物剂用于防治HPV感染。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

逦１００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ邋Ｂ邋（＾ｇ／ｍｌ）逡逑图１－１：丹酚酸Ｂ能显著抑制ＨＰＶ病毒感染靶细胞（Ａ．ＨＰＶ－６；Ｂ．ＨＰＶ－１６；Ｃ．ＨＰＶ－１８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１：邋Ｔｈｅ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ邋Ｂ邋ｏｎ邋ＨＰＶ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋（Ａ．ＨＰＶ－６；邋Ｂ．ＨＰＶ－１６；逡逑Ｃ．ＨＰＶ－１８）逡逑２．丹裔酸Ｂ能作用在病栜入酬胞的早期阶段逡逑通过Ｔｉｍｅ－ｏｆ－ａｄｄｉｔｉｏｎ实验，即在病毒入侵耙细胞的不同时间点（０、２、４、逡逑６、８、１０和１２邋ｈ）加入丹酚酸Ｂ，观察其抗病毒活性的变化，分析药物可能的逡逑作用环节。实验结果发现，在病毒进入靶细胞前加入丹酚酸Ｂ邋（５０卩ｇ／ｍｌ），其逡逑几乎完全抑制ＨＰＶ病毒的复制，抑制率达８０？１００％邋（图１－２）。但当在病毒感逡逑染靶细胞后加入丹酚酸Ｂ时，其抗病毒活性逐渐下降，且随着病毒感染时间的逡逑延长，丹酚酸Ｂ抗病毒活性也进一步下降。上述结果提示，丹酚酸Ｂ对病毒进逡逑１５逡逑

３．丹酚酸Ｂ抑制ＨＰＶ病毒结合靶细胞逡逑病毒结合靶细胞是ＨＰＶ感染宿主细胞的第一步，前述结果提示丹酚酸Ｂ可逡逑能在病毒感染细胞的早期阶段发挥作用，这种作用是否是由于药物抑制了病毒逡逑与靶细胞之间的结合呢？由于ＨＰＶ邋Ｌ１基因编码的ＨＰＶ邋Ｌ１蛋白是ＨＰＶ的主要逡逑衣壳蛋白，其是介导病毒入侵靶细胞的关键因子。这里，我们采用免疫荧光染逡逑色法对感染细胞表面的ＨＰＶ邋１６邋Ｌ１蛋白染色，观察药物对细胞表面Ｌ１蛋白表达逡逑的影响。将丹酚酸Ｂ与ＨＰＶ１６病毒混合液加入ＨｅＬａ细胞中孵育，２４ｈ后弃上逡逑清，对ＨＰＶ邋１６邋Ｌ１蛋白进行荧光染色后观察发现，ＨＰＶ病毒处理组中，细胞表逡逑面观察到显著的Ｌ１蛋白荧光表达（图１－３邋Ｂ），邋１０邋ｐｇ／ｍｌ丹酚酸Ｂ处理组（图１－３逡逑Ｃ）与１００ｐｇ／ｍｌ丹酚酸Ｂ处理组（图１－３Ｄ）中细胞表面Ｌ１蛋白的荧光表达量逡逑显著下降，且呈剂量依赖性。上述结果表明，丹酚酸Ｂ能有效抑制ＨＰＶ与靶细逡逑胞的结合。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑

１２、２５、５０及１００ｊｘｇ／ｍｌ）丹酚酸Ｂ的ＨＰＶ病毒颗粒，其黏附靶细胞的能力明逡逑显下降，后期恢复生理条件时，病毒内吞并感染靶细胞的能力显著下降，且具逡逑有显著的剂量依赖性（图１－４）。上述结果表明，丹酚酸Ｂ能一定程度地抑制ＨＰＶ逡逑病毒黏附靶细胞，进而抑制病毒内吞入胞过程，其可能是丹酚酸Ｂ抗ＨＰＶ病毒逡逑的作用机制之一。逡逑２００００邋ｔ逦＾邋ＨＰＶ－１６逡逑＿邋１５０００－邋ｇ逦＊＊＊逦Ｅ３邋ＨＰＶ－１８逡逑皇逦W 逦ｉ逦＊：逦＊＊＊逡逑ｈ邋５０００N■柋哢？逦＊＊＊逡逑！逦３０００

本文编号：2820376