丹参酮ⅡA增强阿霉素抗乳腺癌活性及机制的研究

发布时间：2020-09-17 20:33

　　目的:近年来,乳腺癌的发病率持续上升,已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤。目前,乳腺癌的治疗仍然以手术为主,放化疗治疗为辅。随着基础研究的进展及各类新药的开发,化学治疗在乳腺癌的综合治疗中占有重要的地位,其中,以阿霉素为代表的蒽环类化合物扮演着不可或缺的角色。然而,随着使用时间的延长,一方面乳腺癌细胞容易对阿霉素甚至与其结构无关、作用机制不同的其它化疗药物产生耐药性,导致乳腺癌化疗失败、复发转移;另一方面,阿霉素的长期使用使其对非肿瘤组织尤其是心肌的毒副作用增加,常常限制其临床应用。因此,如何逆转乳腺癌细胞阿霉素耐药并降低阿霉素的毒副作用成为化疗领域研究的热点。乳腺癌耐药的机制十分复杂,主要涉及外排型药物载体蛋白介导、凋亡调控基因介导及肿瘤生存环境变化介导等多种机理。随着人们对乳腺癌耐药机理了解的日益深入,大量针对乳腺癌耐药的逆转策略已经介入基础和临床研究,其中,基于化学药物逆转乳腺癌耐药的研究最早,也是研究最多的逆转策略。但由于目前研究的化疗增敏剂普遍存在中毒剂量与有效剂量相近,且与化疗药物合并使用致抗肿瘤的毒副作用加剧等问题,尚不能广泛应用于临床。理想的化疗药物增敏剂应具备以下条件:(1)安全、毒副作用小或对机体具有保护作用;(2)具有一定的抗肿瘤作用;(3)稳定、体内半衰期较长。丹参酮ⅡA是我国传统中药丹参的有效成分之一,临床不仅广泛应用于缺血性心脏病的治疗,也可应用于感染、肝炎等疾病的治疗。现代药理学研究显示,丹参酮ⅡA除具有心血管保护作用外,还具有抗肿瘤作用。虽然阿霉素在乳腺癌的综合治疗中占有重要的地位,但因阿霉素所引起的骨髓抑制、心肾毒性、以及机体对化疗药物产生耐药性等原因,常致化学治疗效果降低,甚至导致化学治疗失败。鉴于阿霉素所引起的许多毒副作用正是丹参酮ⅡA参与治疗的重点之处,而丹参酮ⅡA也具有抗肿瘤作用,因此,丹参酮ⅡA符合作为化疗蒽敏剂的条件,但关于丹参酮ⅡA作为化疗蒽敏剂的研究却甚少。本研究以人乳腺癌MCF-7细胞和其所对应的阿霉素耐药MCF-7/dox细胞为研究对象,并制备相应的裸鼠乳腺癌模型,从细胞和动物两个水平观察丹参酮ⅡA对阿霉素抗乳腺癌活性的影响并探讨其相关机制,为恶性肿瘤化疗中研发安全、高效的化疗药物增敏剂提供有价值的理论基础和可靠的实验依据。研究方法:1、丹参酮ⅡA对阿霉素抗乳腺癌细胞活性的影响用丹参酮ⅡA干预阿霉素作用的人乳腺癌MCF-7及MCF-7/dox细胞,MTS法检测丹参酮ⅡA干预对阿霉素抑制乳腺癌细胞增殖的影响;流式细胞法检测丹参酮ⅡA干预对阿霉素诱导乳腺癌细胞凋亡及消除乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)的影响;Transwell法检测丹参酮ⅡA干预对阿霉素抑制乳腺癌细胞侵袭的影响;流式细胞法检测丹参酮ⅡA干预对乳腺癌细胞摄取阿霉素量的影响。2、丹参酮ⅡA对阿霉素抗乳腺癌细胞活性影响的机制分别用阿霉素、阿霉素+无毒剂量丹参酮ⅡA、阿霉素+无毒剂量丹参酮ⅡA+PTEN抑制剂bpV(HOpic)干预人乳腺癌MCF-7及MCF-7/dox细胞,同时设置不加药物处理的对照组。MTS法检测干预后乳腺癌细胞增殖抑制率的变化;流式细胞法检测干预后乳腺癌细胞凋亡率和BCSCs数量的变化;Transwell法检测干预后乳腺癌细胞侵袭力的变化;流式细胞法检测干预后乳腺癌细胞摄取阿霉素量的变化;Western blot法检测PTEN、p-AKT、P-gp、BCRP、MRP1的表达变化。3、丹参酮ⅡA对阿霉素抗乳腺癌活性影响的体内研究构建MCF-7裸鼠乳腺癌动物模型,待肿瘤瘤体长至约0.7cm~3大小将裸鼠随机分成4组,采用腹腔给药的方式隔日分别注射生理盐水、丹参酮ⅡA、阿霉素、阿霉素+丹参酮ⅡA,每天检测各组裸鼠平均体重、肿瘤平均相对体积的变化;取骨髓制备涂片,瑞氏染色法观察各组裸鼠的骨髓增生程度;取静脉血分离血浆,生化分析仪检测心肌酶、肾功的变化。结果:1、丹参酮ⅡA对阿霉素抗乳腺癌细胞活性的影响丹参酮ⅡA剂量依赖性的抑制MCF-7及MCF-7/dox细胞的增殖;阿霉素与不同浓度的丹参酮ⅡA联合使用时,随着丹参酮ⅡA浓度的增加,二者对MCF-7及MCF-7/dox细胞的增殖抑制作用就越明显;即使是无毒剂量的丹参酮ⅡA与阿霉素联合使用时,也能明显增强阿霉素对MCF-7及MCF-7/dox细胞的增殖抑制和侵袭抑制作用、诱导凋亡作用、杀伤BCSCs作用(P㩳0.05),同时,在同一浓度阿霉素处理的条件下,无毒剂量的丹参酮ⅡA能明显增加MCF-7及MCF-7/dox细胞内阿霉素积累的量(P㩳0.05)。2、丹参酮ⅡA对阿霉素抗乳腺癌细胞活性影响的机制与阿霉素敏感的MCF-7细胞相比较,PTEN在阿霉素耐药的MCF-7/dox细胞中表达明显降低(P㩳0.05),而p-AKT在阿霉素耐药的MCF-7/dox细胞中表达明显增加(P㩳0.05),同时,外排型ABC转运蛋白P-gp、BCRP及MRP1在阿霉素耐药的MCF-7/dox细胞中表达明显增加(P㩳0.05);与单用阿霉素组相比较,阿霉素与丹参酮ⅡA联合使用时,能明显上调MCF-7及MCF-7/dox细胞内PTEN的表达、下调MCF-7及MCF-7/dox细胞内p-AKT的表达、抑制MCF-7及MCF-7/dox细胞外排型ABC转运蛋白P-gp、BCRP及MRP1的表达,联合用药前后相比较,具有明显的统计学意义(P㩳0.05);PTEN抑制剂bpV(Hopic)干预后,丹参酮ⅡA对阿霉素抗人乳腺癌MCF-7及MCF-7/dox细胞活性的增强作用被大大降低,虽然PTEN抑制剂bpV(Hopic)干预致阿霉素联合丹参酮ⅡA处理的MCF-7及MCF-7/dox细胞后细胞内PTEN的表达明显降低(P㩳0.05)、p-AKT的表达明显增加(P㩳0.05),但外排型ABC转运蛋白P-gp、BCRP及MRP1的表达没有明显变化(P㧐0.05)。3、丹参酮ⅡA对阿霉素抗乳腺癌活性影响的体内研究成功构建裸鼠乳腺癌模型;与单用阿霉素组或丹参酮ⅡA组相比较,阿霉素与丹参酮ⅡA联合应用时能明显抑制裸鼠肿瘤生长(P㩳0.05);同时,能够明显降低阿霉素所引起的体重减轻、骨髓造血抑制、心脏毒性、肾功能损伤等毒副作用。结论:1、丹参酮ⅡA能明显增强阿霉素抗乳腺癌细胞的活性;2、丹参酮ⅡA是通过上调PTEN的表达从而抑制AKT通路、下调外排型ABC转运蛋白(P-gp、BCRP、MRP1)的表达实现其增强阿霉素抗乳腺癌细胞活性;3、丹参酮ⅡA在明显增强阿霉素抗乳腺癌细活性的同时,能明显降低阿霉素所引起的毒副作用。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：

丹参酮ⅡA,细胞增殖,阿霉素,化疗敏感性

图 1.1 丹参酮ⅡA 对 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞增殖的影响参酮ⅡA 干预对阿霉素抑制 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞增殖的 2.0 μg/mL 的阿霉素与不同浓度的丹参酮ⅡA 联合使用时，随着丹参酮，二者对 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞的增殖抑制作用就越明显（图 1.量的 0.02mg/L 的丹参酮ⅡA 与不同浓度的阿霉素联合使用时，无毒剂量明显增强阿霉素对 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞的增殖抑制作用（图 1 细胞，无毒剂量的丹参酮ⅡA 将阿霉素的化疗敏感性提高了 1.4±0.1/dox 细胞，无毒剂量的丹参酮ⅡA 将阿霉素的化疗敏感性提高了 1.782C）。与阿霉素敏感的 MCF-7 细胞相比较，丹参酮ⅡA 将阿霉素对阿CF-7/dox 细胞的化疗敏感性提高的更明显，二者相比较具有明显的统计0.05）。

阿霉素,丹参酮ⅡA,细胞增殖

图 1.2 丹参酮ⅡA 干预对阿霉素抑制 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞增殖的影响注：*，与 MCF-7 细胞组相比，P 㩳0.05。3.3 丹参酮ⅡA 干预对阿霉素诱导 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞凋亡的影响如图 1.3 所示，与单用阿霉素组相比较，阿霉素与无毒剂量的 0.02mg/L 的丹参酮ⅡA 联合使用时，能明显提高阿霉素诱导 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞的早期凋亡（P 㩳0.05）。因阿霉素诱导细胞死亡的方式与阿霉素处理的时间和剂量密切相关，本研究选择的阿霉素的剂量不高，且处理时间不长，虽然丹参酮ⅡA 也能提高阿霉素诱导MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞的晚期凋亡和坏死，但与单用阿霉素组相比较，没有明显的统计学意义（P 㧐0.05）。

阿霉素,丹参酮ⅡA,细胞凋亡

图 1.3 丹参酮ⅡA 干预对阿霉素诱导 MCF-7 及 MCF-7/dox 细胞凋亡的影响注：*，与对照组相比，P 㩳0.05；#，与单用阿霉素组相比，P 㩳0.05。3.4 丹参酮ⅡA 干预对阿霉素杀伤 BCSCs 作用的影响BCSCs 被认为是化学治疗的关键靶点，有效的消除 BCSCs 可以明显提高化学治疗的效果[20]。为了进一步研究丹参酮ⅡA 对阿霉素抗肿瘤活性的影响，我们通过检测阿霉素与无毒剂量的丹参酮ⅡA 联合用药前后细胞 CD44+/CD24 /low的表达变化情况来评估丹参酮ⅡA 对阿霉素杀伤 BCSCs 的影响。结果如图 1.4 所示，与单用阿霉素组相比较，阿霉素与无毒剂量的 0.02mg/L 的丹参酮ⅡA 联合使用时，能明显提高阿霉素杀伤 BCSCs 的能力，联合用药前后相比较，具有明显的统计学意义（P 㩳0.05）。

【参考文献】