肾衰营养胶囊通过减轻氧化应激和自噬改善CKD骨骼肌萎缩的机制研究
发布时间：2020-09-18 16:07
背景:蛋白质能量消耗(Protein-energy wasting,PEW)是慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)的重要并发症,和患者心血管事件发病率及死亡风险密切相关。骨骼肌萎缩是诊断CKD-PEW最可靠的标准。CKD-PEW目前无特异性治疗方法,肾衰营养胶囊对CKD-PEW患者疗效显著,但作用机制不明,很难为中药的良好疗效提供理论依据。PEW骨骼肌萎缩的主要病理机制包括泛素-蛋白酶体系统、caspase-3和肌抑素的激活。近年来,越来越多的证据表明,氧化应激和自噬与CKD-PEW骨骼肌萎缩密切相关。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)可以作为细胞信号分子启动自噬体的形成,自噬则通过去除蛋白质聚集物和受损的细胞器来减少氧化损伤,而过度自噬又进一步造成组织损伤。氧化应激和自噬相互作用,可能是参与PEW骨骼肌萎缩的重要因素。课题组最近研究发现,肾衰营养胶囊可以调节CKD大鼠氧化应激和自噬状态,同时改变骨骼肌中p-Akt、p-mTOR、CREB等相关蛋白的表达水平。目前尚无基于氧化应激和自噬探讨中药对PEW骨骼肌萎缩治疗作用的相关报道。目的:以5/6肾切除模型大鼠和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)诱导的C2C12骨骼肌细胞为研究对象,通过体内和体外实验明确肾衰营养胶囊对CKD-PEW骨骼肌萎缩的治疗作用,探讨其对氧化应激和自噬的影响,并研究相关分子机制,阐明肾衰营养胶囊改善CKD-PEW骨骨骼肌萎缩的作用途径。方法:通过5/6肾切除方法建立CKD大鼠模型,设置假手术组(Sham)、模型组(Model)、肾衰营养胶囊(SSYYJN)干预组和开同(KA)对照组。以血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、24h尿蛋白、炎症因子等作为CKD的疗效评价标准,以血清白蛋白(Serum albumin,ALB)、体重、肌肉质量、骨骼肌横截面积等作为改善PEW和骨骼肌萎缩的评价指标,并通过检测肾衰营养胶囊对TNF-α诱导的C2C12小鼠成肌细胞增殖和凋亡的影响,明确肾衰营养胶囊对CKD-PEW骨骼肌萎缩的治疗作用;以ROS活性、线粒体形态、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平为标准,检测肾衰营养胶囊对CKD大鼠和TNF-α诱导的C2C12成肌细胞氧化应激水平的影响;通过电镜检测骨骼肌组织中自噬小体(autophagosomes,APs)、自噬溶酶体(autolysosome,ALs)数目,通过蛋白质印迹法(Westernblotting,WB)检测p62和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平,探讨肾衰营养胶囊对自噬的影响;最后通过检测CKD大鼠骨骼肌和C2C12细胞中磷酸化磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)、p-Akt、p-mTOR、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)、自噬相关蛋白 7(autophagy related 7,Atg7)、自噬相关蛋白5(autophagy related 5,Atg5)等蛋白的表达,并通过在C2C12细胞系中构建Nox2高表达稳定株,反向验证肾衰营养胶囊对氧化应激和自噬的调节作用,阐明肾衰营养胶囊对CKD-PEW的作用机制。结果:体内实验表明肾衰营养胶囊干预后,CKD大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白及炎症因子水平较Model组显著降低;大鼠体重、骨骼肌重量、ALB水平较Model组显著增加,其治疗效果和开同组无明显差异;HE结果显示,肾衰营养胶囊干预后,CKD大鼠的骨骼肌体积和横截面积较Model组有所增加;体外实验表明,肾衰营养胶囊含药血清干预组可以减轻TNF-α诱导的C2C12细胞凋亡,促进C2C12细胞增殖。肾衰营养胶囊治疗组线粒体损伤程度较Model组显著减轻,CKD大鼠骨骼肌中Aps和ALs的数目均较Model组减少。同时,体内体外实验均表明,肾衰营养胶囊可以减少ROS含量,增强CKD状态下SOD、GSH-Px、CAT活性,降低MDA水平,并且在减少LC3蛋白表达量的同时增强p62蛋白的表达。基于肾衰营养胶囊作用机制的研究表明:肾衰营养胶囊干预后,CKD大鼠骨骼肌组织和C2C12细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白水平较模型组升高,但自噬相关蛋白CREB、Atg5、Atg7表达水平较模型组降低;在高表达Nox2的C2C12成肌细胞稳定株中,肾衰营养胶囊对p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及自噬相关蛋白CREB、Atg5、Atg7的调节作用减弱。结论:肾衰营养胶囊通过调节PI3K/Akt/mTOR/CREB信号通路,减轻5/6肾切除模型大鼠和TNF-α诱导的C2C12细胞氧化应激和自噬水平,改善CKD-PEW骨骼肌萎缩。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
鉴定为凋亡细胞，拍摄五个随机显微镜视野，将凋亡细胞的百胞总数的比例量化为凋亡细胞。逡逑计分析逡逑组的数据分析采用ｔ检验，使用单因素方差分析法（ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯ四组数据进行分析。所有统计数据均采用ＳＰＳＳ１３．０分析。数据表示，双侧检验Ｐ＜0．0５被认为具有统计学意义。逡逑果逡逑Ｉ）大鼠模型的制备：逡逑左侧肾组织２／３切除术１周后，进行右肾切除，两次手术共切除术４周后检测动物一般指标、血生化和２４ｈ尿蛋白，一般指少，体重减轻，反应灵敏度下降；血生化提示Ｓｃｒ、ＢＵＮ明显升高则提示造模成功。逡逑Ｉ逡逑
第一章：肾衰营养胶囊对ＣＫＤ骨骼肌萎缩的改善作用。逡逑、肾衰营养胶囊对ＣＫＤ大鼠腓肠肌体积的影响逡逑体视荧光显微镜下显示，模型组大鼠的腓肠肌体积较假手术组显著减少（邋０．００１）；肾衰营养胶囊和开同治疗组的腓肠肌体积比ＣＫＤ模型组大鼠显著口，向假手术组水平靠拢。肾衰营养胶囊组和开同组之间无明显差异。提示营养胶囊可以X椉樱茫耍哪Ｐ痛笫箅璩√寤纳乒趋兰∥踝刺＃煎澹埃埃担煎澹埃埃埃薄ｅ义希樱瑁幔礤危停铮洌澹戾危樱樱伲伲剩五危耍铃义
本文编号：2821873
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
鉴定为凋亡细胞，拍摄五个随机显微镜视野，将凋亡细胞的百胞总数的比例量化为凋亡细胞。逡逑计分析逡逑组的数据分析采用ｔ检验，使用单因素方差分析法（ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯ四组数据进行分析。所有统计数据均采用ＳＰＳＳ１３．０分析。数据表示，双侧检验Ｐ＜0．0５被认为具有统计学意义。逡逑果逡逑Ｉ）大鼠模型的制备：逡逑左侧肾组织２／３切除术１周后，进行右肾切除，两次手术共切除术４周后检测动物一般指标、血生化和２４ｈ尿蛋白，一般指少，体重减轻，反应灵敏度下降；血生化提示Ｓｃｒ、ＢＵＮ明显升高则提示造模成功。逡逑Ｉ逡逑
第一章：肾衰营养胶囊对ＣＫＤ骨骼肌萎缩的改善作用。逡逑、肾衰营养胶囊对ＣＫＤ大鼠腓肠肌体积的影响逡逑体视荧光显微镜下显示，模型组大鼠的腓肠肌体积较假手术组显著减少（邋０．００１）；肾衰营养胶囊和开同治疗组的腓肠肌体积比ＣＫＤ模型组大鼠显著口，向假手术组水平靠拢。肾衰营养胶囊组和开同组之间无明显差异。提示营养胶囊可以X椉樱茫耍哪Ｐ痛笫箅璩√寤纳乒趋兰∥踝刺＃煎澹埃埃担煎澹埃埃埃薄ｅ义希樱瑁幔礤危停铮洌澹戾危樱樱伲伲剩五危耍铃义
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