脂质体姜黄素通过调控MicroRNA调节乳腺癌细胞对阿霉素药物的敏感性
发布时间：2020-09-24 05:00
目的:本实验致力于初步研究脂质体姜黄素通过调控microRNA途径影响乳腺癌细胞对阿霉素药物的敏感性,并分析其可能的作用机制。以此为指导临床使用姜黄素对抗人乳腺癌化疗耐药提供理论依据。方法:(1)利用脂质体包封技术制备脂质体姜黄素。(2)选择不同浓度的脂质体姜黄素(6.8,13.58,27μM),分别与用不同浓度阿霉素(490,98,19.6,3.92,0.784,0.1568μM)处理后的人乳腺癌耐阿霉素MCF-7/ADR细胞共孵育48小时后,利用MTT法测定不同浓度脂质体姜黄素孵育下阿霉素对MCF-7/ADR细胞的抑制率和半数致死量(IC50),并且计算各组药物的协同增效指数(CI)。(3)采用miRNA和mRNA微阵列分析在敏感株、耐药株、经脂质体姜黄素处理的耐药株中筛选出差异表达的微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)。(4)通过生物信息学预测软件预测差异表达的miRNA可能的靶基因,并与mRNA微阵列中差异表达的靶基因取交集。(5)荧光定量PCR(RT-qPCR)检测对5个在3株细胞株中差异表达的miRNAs(hsa-miR-29b-1-5p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-6068,hsa-miR-6790-5p 和 hsamiR-4417)以及mRNAs(DDIT4,EPAS1,VEGFA,RPS14,DCDC2)进行结果验证。(6)选择hsa-miR-29b-1-5p进一步研究耐药机制,转染hsa-miR-29b-1-5p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitors)对细胞进行干预后,采用MTT法检测miR-29b-1-5p表达变化对乳腺癌细胞耐药性的影响。(7)通过KEGG通路富集分析和PPI蛋白交互作用网络分析可能参与阿霉素耐药机制的信号通路及靶基因。统计学分析实验结果均经SPSS 22.0软件分析。各实验至少独立重复3次,重复性好。数据以平均数±标准差表示,组间比较采用秩和检验。以P0.05表示有统计学意义。结果:(1)MTT法检测结果显示,阿霉素对经过脂质体姜黄素孵育后的人乳腺癌耐阿霉素MCF-7/ADR细胞的IC50明显下降,并且两者对细胞抑制率有协同增效作用。(2)miRNA和mRNA芯片结果显示,与耐药株MCF-7/ADR细胞相比,miRNA和mRNA在亲本MCF-7细胞和经脂质体姜黄素处理的MCF-7/ADR细胞中的表达差异明显,共发现67个差异表达的miRNA和323个差异表达的mRNA。根据TargetScan,Pictar,MicroCosm和miRDB预测软件预测表达差异的miRNA可能的靶基因,与mRNA芯片结果取交集后发现20个共同靶基因。(3)从差异表达的miRNA和mRNA中挑选了 5个miRNA和5个mRNA进行RT-qPCR验证,验证结果与芯片结果基本一致。(4)与阴性对照相比,MCF-7/S细胞转染miR-29b-1-5p mimics后,其表达在细胞内明显增加,细胞的IC50也明显升高;将miR-29b-1-5p转染至MCF-7/ADR细胞后,其表达在细胞内明显降低,细胞的IC50也明显下降;经脂质体姜黄素处理的MCF-7/ADR细胞转染miR-29b-1-5p mimic后,miR-29b-1-5p在细胞内表达明显增加,并且细胞IC50较前明显升高。(5)KEGG通路富集分析和PPI蛋白交互作用网络分析显示MAPK、mTOR、PI3K-Akt、AMPK、TNF、Ras 等信号通路以及 PPARG,RRM2、SRSF1、EPAS1 等下游基因可能参与了人乳腺癌对阿霉素的耐药机制。结论:(1)脂质体姜黄素能在一定程度上逆转人乳腺癌对阿霉素的耐药性。(2)脂质体姜黄素通过调控microRNA的表达来影响相关信号通路可能是其调节乳腺癌细胞对阿霉素药物敏感性的其中一条重要分子途径。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：
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中众所周知的一类分子［１３５］。在黑色素瘤细胞中，ＨＭＧＡ２通过下调ｍｉＲ－２００ｂ的表达X椙垮义习┲⒌淖疲扑乜梢酝ü黾樱恚椋遥常常獾谋泶镆种葡赴ㄒ苹频募せ睿系鞯腻义希恚椋遥常常庵苯影邢虻骺兀龋停牵粒不蛞种坪谏亓龅那ㄒ疲郏保常叮保常罚荩ㄍ迹保矗Ｔ谝认侔┫赴校义辖扑匾部梢陨系鳎恚椋遥罚系鞯模恚椋遥钒邢蛳碌飨掠位颍樱牛裕复佣灾档鸵认侔┫稿义习那窒芰Γ郏保常福荨ｅ义希牛簦颍幔悖澹欤欤酰欤幔蝈危茫酰颍悖酰恚椋铄澹恚礤义希牛妫猓猓常蓿蓿咤澹睿澹咤危垮澹椋澹眨澹В湾澹海澹保蓿卞澹椋欤铄澹剩殄澹 鲥澹В欤欤у澹恚礤澹摺鲥澹椋蓿椋妫幔椋殄澹保掊濉觯俊鲥危摺鲥澹椋殄澹瑁桑龋殄义
本文编号：2825337
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：
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中众所周知的一类分子［１３５］。在黑色素瘤细胞中，ＨＭＧＡ２通过下调ｍｉＲ－２００ｂ的表达X椙垮义习┲⒌淖疲扑乜梢酝ü黾樱恚椋遥常常獾谋泶镆种葡赴ㄒ苹频募せ睿系鞯腻义希恚椋遥常常庵苯影邢虻骺兀龋停牵粒不蛞种坪谏亓龅那ㄒ疲郏保常叮保常罚荩ㄍ迹保矗Ｔ谝认侔┫赴校义辖扑匾部梢陨系鳎恚椋遥罚系鞯模恚椋遥钒邢蛳碌飨掠位颍樱牛裕复佣灾档鸵认侔┫稿义习那窒芰Γ郏保常福荨ｅ义希牛簦颍幔悖澹欤欤酰欤幔蝈危茫酰颍悖酰恚椋铄澹恚礤义希牛妫猓猓常蓿蓿咤澹睿澹咤危垮澹椋澹眨澹В湾澹海澹保蓿卞澹椋欤铄澹剩殄澹 鲥澹В欤欤у澹恚礤澹摺鲥澹椋蓿椋妫幔椋殄澹保掊濉觯俊鲥危摺鲥澹椋殄澹瑁桑龋殄义
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