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慢性应激诱导的青年雄性抑郁大鼠的脑蛋白质组学研究及大黄素干预

发布时间:2020-09-24 14:15
   背景抑郁症具有情绪低落、兴趣丧失和快感缺失三大核心症状,同时还伴有焦虑、自罪自责、精神病性症状、自杀倾向、睡眠障碍、食欲紊乱等。世界卫生组织有关全球疾病总负担的统计数据显示,预计至2020年抑郁症的疾病负担将升至第2位。慢性应激可以诱导包括抑郁症在内的心境障碍,但是,在遭受同样应激的条件下,还有相当一部分个体并未发生抑郁等心境障碍。实验研究也已证明,动物对慢性应激的敏感性也存在显著差异。经历一定程度应激后未发生抑郁等心境障碍的现象被认为是应激抵抗,这些个体被认为拥有避免应激对自身状态造成不良影响一种能力,即应激抵抗力。在过去的10多年中,抵抗力受到大量研究的关注。一些研究已经证明,抵抗力的具备不仅仅是因为缺少了那些存在于应激易感者中的不良改变,更重要的可能是因为在抵抗个体中存在着使他们应变能力增强的关键性分子的改变,但是其潜在的机制并不清楚。因此抑郁和应激抵抗个体的脑蛋白质组学研究显得尤为重要。目的研究慢性不可预测温和应激(Chronic unpredicted mild stress,CUMS)诱导的大鼠的不同行为学表现及海马内不同变化。通过蛋白质组学定量分析各组海马组织,力图发现与抑郁和应激抵抗相关的差异蛋白及生物过程,揭示针对应激发生不同反应的可能的分子机制。方法选取8周龄的SD大鼠,每日随机给予大鼠以下刺激中的2-3种,包括:禁食(24 h)、禁水(24 h),群居(每4-5只饲养在一个小鼠笼内,12 h)、倾斜鼠笼(16 h)、鼠笼环境潮湿(将200 ml的水倒入鼠笼)、白噪音刺激(85 dB,6 h)、空瓶子(2h)、热刺激(45 ℃,15 min)、冷刺激(4 ℃,2 h)、持续光照(12 h)和闪光灯刺激(200 Hz,4 h),持续7周。刺激前后均用糖水偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验评价大鼠的行为状态。根据行为学表现,应激后分为三组,正常对照组、应激抵抗组、应激敏感组(即抑郁组)。采用尼氏染色和高尔基染色分别检测海马神经元的数目和海马神经元的树突棘。通过免疫组化方法研究小胶质细胞的形态,并进行体视学分析。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定海马内促炎因子的水平。检测海马组织脂质氧化指标(丙二醛)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶)的水平和活性。采用基于iTRAQ技术的蛋白质组学定量分析各组海马组织,筛选出差异表达蛋白;对差异蛋白进行生物学分析:GO注释及GO富集分析,寻找与差异表达蛋白显著相关的生物学过程。然后采用免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光的方法对相关蛋白及生物学过程进行验证及进一步深入研究。结果1.抑郁组的大鼠糖水消耗百分比下降到45%,而对照组和应激抵抗组仍为80%以上;抑郁组的大鼠在水中静止不动的时间为220 s,明显高于对照组的78 s和应激抵抗组的82 s;抑郁组大鼠5 min内穿越的格子数目约30个,这明显低于对照组的149个和应激抵抗组的138个,抑郁组大鼠的双上肢垂直上抬的次数下降至8次,少于对照组的27和应激抵抗组的26;以上结果,抑郁组大鼠表现出明显的抑郁样行为,但是应激抵抗组大鼠并未表现出抑郁样行为。2.尼氏染色结果显示抑郁组海马CA1、CA3、DG区神经元面积较对照组均下降30%左右,而应激抵抗组与对照组相比没有差异。海马树突棘研究结果显示,抑郁组大鼠海马CA1区的树突棘和成熟的蘑菇型树突棘分别为4.3个/10 μm、1.7个/50 μm,对照组的分别为10.7个/10 μm、6.7个/50 μm,应激抵抗组分别为10个/10 μm、6.3个/50μm,表明抑郁组大鼠海马神经元数目及其树突棘数目下降,应激抵抗组没有发生神经元及其树突棘的丢失。3.小胶质细胞形态学研究结果显示,抑郁组海马区三种状态的小胶质细胞所占百分比分别为静息态16.4%、中间态35.2%、激活态48.4%,对照组则分别为静息态68.7%、中间态24.3%、激活态7%,而应激抵抗组为静息态45.2%、中间态45.8%、激活态9%。抑郁组海马区处于激活态的小胶质细胞高于另外两组,而应激抵抗组的海马区小胶质细胞更多的是处于中间态。4.ELISA结果显示,对照组海马IL-1β、TNF-a的水平分别为50.8 pg/mg蛋白,26.2 pg/mg蛋白,应激抵抗组分别为48.7 pg/mg蛋白,24.1 pg/mg蛋白,抑郁组分别为108.4 pg/mg蛋白,56.4 pg/mg蛋白,明显高于对照组和应激抵抗组。5.氧化应激指标检测结果显示,对照组海马丙二醛的水平为0.41 nmol/mg蛋白,应激抵抗组为0.37 nmol/mg蛋白,抑郁组为0.76 nmol/mg蛋白,明显高于对照组和应激抵抗组;对照组海马超氧化物歧化酶的活性为100.8 U/mg蛋白,应激抵抗组为151.2 U/mg蛋白,高于对照组,抑郁组为62.5 U/mg蛋白,明显低于对照组和应激抵抗组。6.iTRAQ技术总共检测到4690个蛋白,并对3645个蛋白进行了定量分析。按照差异表达条件(比值1.2或0.83,且p0.05)筛选到了 164个蛋白,其中,抑郁组与对照组相比,上调20个,下调12个;应激抵抗组与对照组相比,上调21个,下调43个;应激抵抗组与抑郁组相比,上调12个,下调46个。通过对差异蛋白进行GO富集分析,发现在抑郁组与对照组,上调蛋白参与的生物过程主要富集在炎症过程、物质和能量代谢、对应激的反应,下调蛋白参与的生物过程主要富集在突触可塑性、离子平衡、物质转运;在应激抵抗组与对照组,上调蛋白参与的生物过程主要富集在对应激的反应、信号通路、物质和能量代谢、突触可塑性,下调蛋白参与的生物过程主要富集在炎症过程、对应激的反应、物质和能量代谢、物质转运;在应激抵抗组与抑郁组,上调蛋白参与的生物过程主要富集在物质转运、突触可塑性、对应激的反应、发育过程、物质和能量代谢、物质转运,下调蛋白参与的生物过程主要富集在炎症过程、对应激的反应、信号通路等。7.免疫印迹实验表明,与对照组相比,抑郁组大鼠海马mGluR1,mGluR2,NR1的水平明显下降,tau蛋白在丝氨酸396位点(pS396)的磷酸化水平上升了 37%,在丝氨酸404位点(pS404)的磷酸化水平上升了 127%,在苏氨酸(pT205)的磷酸化水平上升了 75%。8.免疫印迹实验结果显示,与对照组相比,抑郁组大鼠海马EAAT2水平下降了37%,应激抵抗组上升了 33%。9.免疫荧光实验结果表明,与对照组相比,抑郁组大鼠海马星形胶质细胞可塑性降低,应激抵抗组海马星形胶质细胞可塑性升高。10.抑郁组Nrf2的激活形式表达量明显下降,且少有进入细胞核内发挥作用,而在应激抵抗组海马Nrf2的激活形式表达量明显增加,且更多的入核发挥作用。11.抑郁组ERK在苏氨酸202/204位点(p-ERK,Thr202/204)的磷酸化水平降低44%,在应激抵抗组升高390%,抑郁组AKT在丝氨酸473位点(p-AKT,Ser473)的磷酸化水平降低71%,在应激抵抗组升高47%。结论CUMS后,抑郁组的大鼠海马内许多蛋白水平发生异常变化,这些蛋白的异常变化可能介导了突触可塑性、炎症过程、氧化应激、信号通路、物质转运等相关生物学过程的异常,使海马内出现显著的炎症反应、氧化应激反应,从而导致海马神经元数目及其树突棘数目下降、星形胶质细胞可塑性降低等,最终引起抑郁样行为的发生。CUMS后,应激抵抗的大鼠海马内同样存在一些蛋白水平发生变化,这些蛋白可能参与了一系列的生物过程的调控,比如增强氧化磷酸化作用及抗氧化应激能力,使得星形胶质细胞可塑性增强,炎症反应受到抑制,神经元未发生异常病变,从而成功抵制了抑郁样行为的发生。背景抑郁症是心境障碍的一种,以显著而持久的心境低落为主要临床特征,且反复发作。尽管抑郁症的发病机制还不明确,但大量研究表明炎症反应和氧化应激反应在抑郁症的病理生理过程中发挥重要作用。氧化应激与炎症之间在多个层面相互作用相互影响,共同导致病变的发生发展。因此寻找一种同时拥有抗氧化和抗炎作用的药物治疗抑郁症十分必要。目的研究大黄素对于慢性不可预测温和应激诱导的抑郁样行为的治疗作用,并探索其作用机制。 '方法采用CUMS制造抑郁模型,5周后通过糖水偏好实验筛选出有抑郁倾向的大鼠,然后给予大黄素灌胃治疗两周,每日剂量为80mg/kg,给药的过程中应激同前,两周之后,对各组大鼠进行行为学检测,评价其抑郁状态。采用尼氏染色检测海马yL经元,采用高尔基染色检测海马神经元的树突棘。通过免疫组化检测小胶质细胞的形态学变化,并进行体视学分析。采用酶联免疫吸附法测定海马内促炎因子的水平,检测海马组织脂质氧化指标MDA和抗氧化酶(SOD)的水平和活性。采用免疫印迹、免疫组化、免疫荧光实验,检测Nrf2及其磷酸化水平变化,检测GSK3P,PI3K/AKT的变化,检测5-L0的水平变化。采用荧光定量PCR的方法检测miR495,miR139-5p,miR135-5p,miR126-3p的水平变化。结果1.大黄素千预的抑郁倾向组糖水消耗百分比为78.5%,较载体千预的抑郁倾向组明显升高,且与正常对照组相比没有差异。大黄素干预的抑郁倾向组在水中静止不动的时间为79 s,明显低于载体干预的抑郁倾向组的206 s,且与正常对照组相比没有差异。大黄素干预的抑郁倾向组大鼠5 min内穿越的格子数目约124个,这明显高于载体千预的抑郁倾向组25个,且与正常对照组相比没有差异;同时大黄素干预的抑郁倾向组大鼠的双上肢垂直上抬的次数为约22次,这明显高于载体干预的抑郁倾向组的8次,且与正常对照组对比没有差异。2.尼氏染色结果显示,与载体干预的抑郁倾向组相比,大黄素干预的抑郁倾向组的海马CA1、CA3、DG区神经元面积分别增加了25%、19%、22%,且均与正常对照组对比无差异。高尔基染色结果显示,大黄素干预的抑郁倾向组的海马CA1区的树突棘和成熟的蘑菇型树突棘分别为8.3个/10 pm、4个/50μm,明显高于载体干预的抑郁倾向组的4.3个/10 pm、2个/50μm,但仍均低于正常对照组。3.小胶质细胞形态学研究结果显示,载体干预的抑郁倾向组海马区三种状态的小胶质细胞所占百分比分别为静息态16.4%、中间态35.2%、激活态48.4%,而大黄素干预的抑郁倾向组的分别为静息态56.6%、中间态28.8%、激活态14.6%,可见大黄素干预后可明显升高静息态的比例和降低激活态的比例,但其中间态的比例仍高于正常对照组。4.ELISA结果显示,载体干预的抑郁倾向组海马IL-1β、TNF-α的水平分别为110.1 pg/mg蛋白,55.1 pg/mg蛋白,而大黄素将其分别降低到60.5 pg/mg蛋白、32.9pg/mg蛋白,这表明大黄素可以明显降低慢性应激诱导的海马炎症因子水平的升高。氧化应激指标显示,大黄素干预的抑郁倾向组的海马组织的MDA水平为0.39nmol/mg蛋白,SOD活性为90.7 U/mg蛋白,而载体干预的抑郁倾向组分别为0.73nmol/mg蛋白,61.2U/mg蛋白,表明大黄素可以有效改善氧化与抗氧化之间的失衡。5.免疫印迹实验结果表明,与载体干预的抑郁倾向组相比,大黄素干预的抑郁倾向组海马全细胞p-Nrf2水平升高了157%,且比正常对照组也升高了100%。成分蛋白实验结果提示,正常情况下,t-Nrf2在细胞浆和细胞核中均有分布,而p-Nrf2几乎全部分布在细胞核中。慢性应激后,载体干预的抑郁倾向组海马组织的细胞浆内的t-Nr£2水平升高,细胞核内的t-Nrf2水平降低,而大黄素干预后可使细胞浆和细胞核内的t-Nrf2均恢复到正常水平,同时p-Nrf2在载体干预的抑郁倾向组细胞核内水平明显下降,而大黄素干预后,不仅可以增加细胞核内p-Nrf2水平,且高于正常对照组。同时,脑片免疫组化染色结果显示,大黄素干预后P-Nrf2在海马CA1,CA3,DG区的表达f堅黾

本文编号:2825830

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