基于mTOR信号通路探讨氯化两面针碱的抗肿瘤血管生成作用

发布时间：2020-09-25 15:39

　　 氯化两面针碱(Nitidine chloride,NC)是从芸香科花椒属植物两面针(Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.)的根、茎、叶等部位中提取得到的一种苯骈菲啶类生物碱,具有较强的抗肿瘤活性。有研究表明,NC具有抗肿瘤血管生成作用,能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖和迁移,下调HUVECs的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的表达。然而,相关的分子机制尚未得到完全阐明。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号级联反应参与调节肿瘤细胞的血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的激活与分泌,调控肿瘤组织血管的生成。我们前期的酶活性检测结果表明,NC对m TOR蛋白激酶的磷酸化具有抑制作用,m TOR是NC抑制肿瘤血管生成的潜在靶点。因此在本文中,通过动物实验、细胞和分子生物学等实验研究,并结合分子对接模拟,我们初步阐明了基于m TOR信号通路的NC抑制肿瘤血管生成的作用机制,为进一步将NC开发为多靶点的抗肿瘤药物提供实验依据。目的:1.评价NC对斑马鱼幼鱼血管新生和裸鼠移植瘤组织血管生成的作用。2.研究NC对人肝癌细胞诱导的血管生成的作用。3.探讨m TOR信号通路在NC抑制肿瘤血管生成中的调控作用。方法:1.以绿色荧光蛋白(GFP)标记血管的AB品系转基因斑马鱼(基因型:mp805a)幼鱼作为受试对象,评价不同浓度的NC对斑马鱼幼鱼肠下静脉丛发育的影响。2.建立人肝癌SMMC7721细胞裸鼠移植瘤模型,设立Control组、NC组、雷帕霉素(rapamycin,Rapa)对照组和STAT3抑制剂S3I-201对照组共4个组,设定治疗周期为15天。治疗结束,将裸鼠麻醉后处死,取移植瘤组织,以苏木素-伊红(HE)染色法评价NC对移植瘤生长的影响,以透射电子显微镜(TEM)观测移植瘤细胞的超微结构,以免疫蛋白印迹技术(western blotting)研究NC对移植瘤组织中VEGF、MMP2、m TOR、磷酸化m TOR(p-m TOR)、缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)、STAT3和705位点酪氨酸残基磷酸化的STAT3(p-STAT3-Tyr705)等蛋白水平的影响。3.以微孔滤膜双室联合培养系统(Transwell)模拟人肝癌SMMC7721细胞诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖和迁移,评价NC对肝癌细胞诱导的血管生成的抑制作用。采用细胞免疫荧光技术观测NC对人肝癌SMMC7721细胞中VEGF表达的影响4.采用western blotting技术检测NC对人肝癌SMMC7721细胞内VEGF、MMP2、m TOR、p-m TOR、HIF-1α、STAT3、p-STAT3-Tyr705和727位点丝氨酸残基磷酸化的STAT3(p-STAT3-Ser727)等蛋白水平的影响。5.以酶活性检测实验评价NC对m TOR蛋白激酶磷酸化的抑制作用。借助计算机辅助药物设计(computer aided drug design,CADD)软件SYBYL2.0的Surflex-Dock分子对接模块研究配体NC与受体m TOR激酶的相互作用。结果:1.与control组相比,NC组的斑马鱼幼鱼肠下静脉丛的发育受到明显抑制,差异具有统计学意义(P0.001)。2.与Control组比较,各给药组移植瘤的平均重量和体积均明显变小(P0.05)。在HE染色结果中,Control组和S3I-201组的移植瘤组织中可见明显新生血管和管壁中扁平的正常血管内皮细胞,未见到明显的细胞坏死;与Control组相比,NC组和Rapa组的移植瘤组织出现大面积坏死,未见到新生血管。在TEM观测结果中,Control组和S3I-201组的细胞形态正常,线粒体结构完整,染色质分布均匀;与Control组比较,NC组和Rapa组的细胞线粒体受到损伤,核内染色质固缩。3.Western blotting结果表明,与Control组比较,NC组和Rapa组移植瘤组织中的VEGF、MMP2、p-m TOR和HIF-1α等4种蛋白的表达均明显下降,而S3I-201组的上述4种蛋白水平则明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05);此外,NC组、Rapa组和S3I-201组的p-STAT3-Tyr705蛋白表达水平均明显下降,差异均具有统计学意义(P0.001)。4.Transwell实验结果表明,与Control组相比,NC和Rapa均能抑制人肝癌SMMC7721细胞诱导的HUVECs细胞的迁移作用。细胞免疫荧光实验表明,与Control组相比,NC组的SMMC7721细胞的VEGF表达受到抑制。5.细胞实验的Western blotting检测结果表明,与Control组比较,NC组和Rapa组的VEGF、m TOR、p-m TOR和HIF-1α等4种蛋白的表达均明显下降(P0.05)。与Control组比较,NC组、Rapa组、S3I-201组的p-STAT3-Tyr705蛋白的表达水平均明显下降,差异均具有统计学意义(P0.05)。6.酶活性检测结果表明NC能够抑制m TOR激酶的磷酸化,分子对接结果显示NC与m TOR蛋白激酶主要通过氢键和范德华力相互作用。结论:1.NC对斑马鱼幼鱼的血管生成具有抑制作用。2.NC可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长和血管生成。3.通过下调人肝癌SMMC7721细胞的VEGF水平,NC可以抑制SMMC7721细胞诱导的HUVECs细胞的迁移。4.m TOR是NC抑制肿瘤血管生成的作用靶点,NC通过m TOR/HIF-1α信号通路抑制肿瘤血管生成。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：

图 1-1 NC 对 72hpf 斑马鱼幼鱼肠下静脉丛形态的影响（A1-A7 代表空白组、5.24、6.55、8.19、10.24、12.8、16μmol / L NC 组，标尺：100μm）Figure 1-1 Effect of NC on the morphologies of the subintestinal veins of zebrafish larvaes at 72h(A1-A7 represents Control, 5.24, 6.55, 8.19, 10.24, 12.8, 16μmol / L NC group. Scale bars: 100μm

图 1-2 NC 对 72hpf 斑马鱼幼鱼肠下静脉长度的影响（ x±s，n=6） Effect of NC on the length of the subintestinal veins of 72 hpf zebrafish larvaes ( x±s，* P＜0.001；vs Control group制人肝癌 SMMC7721 细胞裸鼠移植瘤的生长

图 1-3 不同实验组代表性的体内移植瘤Figure 1-3 Representative tumors in vivo in different experimental groups

【参考文献】

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本文编号：2826753