双相酶水解制备宝藿苷Ⅰ和薯蓣皂苷元的研究

发布时间：2020-09-28 11:50

　　宝藿苷Ⅰ是淫羊藿发挥功效的重要活性成分之一,具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗氧化以及缓解高血压等作用。常用于制备宝藿苷Ⅰ的方法有柱色谱、酸水解法和酶水解法,由于宝藿苷Ⅰ在原药材中含量较低且极性相似的成分很多,故分离与纯化较为困难;而利用无机酸水解淫羊藿黄酮苷的过程中易产生副产物,不利于制备高纯度的宝藿苷Ⅰ。薯蓣皂苷元是合成甾体激素类药物的重要原料。在原植物中,薯蓣皂苷元通常以与葡萄糖和鼠李糖结合成皂苷的形式存在;因此,断裂糖苷键是获得薯蓣皂苷元的唯一途径。传统酸水解法由于涉及到高浓度的无机酸,且水解完成后产生的废水对环境造成了不利的影响,因而不利于薯蓣皂苷元的清洁生产。本论文旨在构建一种双相酶水解体系并应用于转化淫羊藿苷和薯蓣皂苷制备宝藿苷Ⅰ和薯蓣皂苷元,研究内容分为以下几个部分:1.商品水解酶的筛选及酶水解条件的优化。研究中,以淫羊藿苷转化率为指标,首先比较了β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、柚苷酶和糖化酶水解淫羊藿苷的效果,从而将β-葡萄糖苷酶从中筛选出来;然后采用单因素实验对β-葡萄糖苷酶的水解条件进行优化。结果表明,当酶/淫羊藿苷质量比为3.2:1,酶水解时间为60 mins,缓冲液pH为4.5,酶水解温度为60℃时,β-葡萄糖苷酶水解淫羊藿苷的活性最好。2.构建双相酶水解体系制备宝藿苷Ⅰ的研究。首先对有机试剂进行筛选并优化酶水解时间;然后以淫羊藿苷转化率为指标,优化了淫羊藿苷处理量、乙酸乙酯/缓冲液体积比,并考察了酶液的重复利用性能;最后,采用ESⅠ-MS、~1H-NMR和~(13)C-NMR确定产物的化学结构;此外,本研究还对双相酶水解体系进行了放大实验以及收益预估。结果表明,与传统酶水解法相比,当酶水解时间为2hrs时,新体系可将淫羊藿苷的处理量和转化率分别提高1.5倍和2%;且在减少淫羊藿苷处理量或者延长酶水解时间的条件下,酶液可至少重复使用2次;除此之外,双相体系放大5倍和10倍均对淫羊藿苷转化率影响较小。由此可见,双相酶解法是一种更高效、便捷地用于水解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的方法,具有较强的发展潜力,在工业生产中应用前景良好。3.薯蓣皂苷水解酶的制备及水解条件的优化。研究中,以薯蓣皂苷元收率为评价指标,首先比较了商品酶和实验室培养霉菌产酶的活性,筛选出对薯蓣皂苷水解活性较好的酶;然后,采用单因素实验对霉菌发酵的条件进行优化,以提高霉菌产酶的活性;最后,采用单因素实验对酶水解薯蓣皂苷的反应条件进行了优化。结果表明,当接种量为1 mL,发酵时间为6 d,发酵温度为33℃,柚苷量为0.25 g时,发酵产酶的条件最佳;且当酶/薯蓣皂苷质量比为0.05:1,酶水解时间为36 hrs,缓冲液pH为5.5,水解温度为50℃时,酶水解薯蓣皂苷的条件最佳,薯蓣皂苷元收率为1.51%。4.双相酶水解薯蓣皂苷的研究。以薯蓣皂苷元收率和转移率为指标,首先对酶水解时间和酶量进行优化;然后,以薯蓣皂苷元收率为指标,优化了石油醚/缓冲液体积比,并考察了酶液的重复利用性能;最后,采用ESⅠ-MS、~1H-NMR和~(13)C-NMR确定产物的化学结构。结果表明,当酶水解时间为36 hrs,酶量为4.8mg,石油醚/缓冲液体积比为2:1时,薯蓣皂苷元收率为1.52%;与传统酶水解法相比,在减少薯蓣皂苷处理量的条件下,酶液可至少重复使用2次;且薯蓣皂苷的水解与薯蓣皂苷元的萃取同步进行增加了操作的方便性。由此可见,双相酶水解是一种较为便捷、清洁地从薯蓣皂苷中制备薯蓣皂苷元的方法,体现出较好的应用前景。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章绪论
    1.淫羊藿
        1.1 简介
        1.2 资源分布
        1.3 化学成分
        1.4 淫羊藿功效及作用
    2.宝藿苷I
        2.1 简介
        2.2 药理作用
    3.盾叶薯蓣
        3.1 简介
        3.2 地域分布
        3.3 化学成分
        3.4 功效及药理作用
    4.薯蓣皂苷元
    5.宝藿苷I制备技术的发展概况
        5.1 柱色谱
        5.2 酸水解
        5.3 酶水解法
    6.薯蓣皂苷元制备技术发展概况
        6.1 直接酸水解
        6.2 物理分离-酸水解
        6.3 双相酸水解
        6.4 加压双相酸水解
        6.5 酸水解-超临界CO2萃取法
        6.6 超声辅助提取法
        6.7 微生物转化法
        6.8 酶水解法
    7.主要研究内容
    8.研究目的及意义
    9.本论文的技术路线
第二章商品水解酶的筛选及酶水解条件的优化
    1.材料、试剂及仪器
        1.1 材料
        1.2 试剂
        1.3 仪器
    2.实验方法
        2.1 淫羊藿苷的测定
        2.2 供试品溶液的制备
        2.3 淫羊藿苷转化率的计算
        2.4 商品酶的筛选
        2.5 酶解条件的优化
    3.结果与讨论
        3.1 淫羊藿苷含量测定
        3.2 商品酶的筛选
        3.3 酶水解条件的优化
    本章小结
第三章构建双相酶水解体系制备宝藿苷I的研究
    1.材料、试剂及仪器
        1.1 材料
        1.2 试剂
        1.3 仪器
    2.实验方法
        2.1 淫羊藿苷和宝藿苷I含量测定
        2.2 供试品溶液的制备
        2.3 计算
        2.4 双相酶水解淫羊藿苷体系的构建
        2.5 双相酶水解条件的优化
        2.6 放大实验
        2.7 产物的结构鉴定
    3.结果与讨论
        3.1 淫羊藿苷和宝藿苷I含量测定
        3.2 双相酶水解体系的建立
        3.3 双相酶水解条件优化
        3.4 双相酶水解法与传统酶水解法比较
        3.5 放大实验结果
        3.6 产物结构鉴定
    本章小结
第四章薯蓣皂苷水解酶的制备及水解条件的优化
    1.材料、试剂及仪器
        1.1 材料
        1.2 试剂
        1.3 仪器
    2.实验方法
        2.1 薯蓣皂苷元含量测定
        2.2 供试品溶液的制备
        2.3 薯蓣皂苷元收率的计算
        2.4 薯蓣皂苷的制备
        2.5 薯蓣皂苷水解酶的制备
        2.6 活性酶的筛选
        2.7 发酵条件的优化
        2.8 酶水解的条件优化
    3.结果与讨论
        3.1 薯蓣皂苷元含量测定
        3.2 薯蓣皂苷的制备
        3.3 薯蓣皂苷水解酶的筛选
        3.4 发酵条件的优化
        3.5 酶水解条件的优化
    本章小结
第五章双相酶水解薯蓣皂苷的研究
    1.材料、试剂及仪器
        1.1 材料
        1.2 试剂
        1.3 仪器
    2.实验方法
        2.1 薯蓣皂苷元的含量测定
        2.2 供试品溶液的制备
        2.3 计算
        2.4 双相酶水解条件的优化
        2.5 薯蓣皂苷元的结构解析
    3.结果与讨论
        3.1 薯蓣皂苷元的含量测定
        3.2 双相酶水解条件的优化
        3.3 双相酶水解法与传统酶解法比较
        3.4 产物结构鉴定
    本章小结
全文总结与展望
    一、全文总结
    二、本论文研究的主要创新点与特色之处
    三、工作展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的论文及其他科研成果
附图

【参考文献】