五谷虫干粉脂肪酸促愈合生物学活性和分子机制研究

发布时间：2020-10-09 20:35

　　 背景:近十几年研究表明,脂肪酸作为一种天然产物,被认为具有多种生物活性,包括抗菌、抗癌和促进皮肤愈合等多种生物活性,同时也被认为是一种很有药物开发价值的天然产物。然而对于促进皮肤愈合的相关分子机制研究的还不够透彻。目的:探讨五谷虫脂肪酸提取物对大鼠皮肤创面促愈合的作用及分子机制研究。方法:(1)应用索氏回流提取的方法提取中药五谷虫干粉中的脂肪酸;(2)应用气相色谱-质谱联用法测定五谷虫脂肪酸提取物的成分并计算其各成分的相对百分率;(3)动物在体实验,分三组(凡士林空白组、五谷虫脂肪酸提取物给药组、金万红阳性对照组)局部涂抹给药并检测对急性皮肤创面的促愈合作用;创面愈合率检测:透明膜描记法记录创面愈合情况;创面组织形态学检测:H/E染色观察创面组织形态学改变,以及免疫组化染色检测创面组织增殖情况;(4)体外试验,观察脂肪酸钠盐(FASS)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的活性作用及相关机制检测:1)、应用CCK-8试剂盒检测脂肪酸钠盐对HUVEC细胞的药效及毒性作用;2)、血细胞计数方法检测脂肪酸钠盐对HUVEC细胞的促增殖作用;3)、应用划痕实验和Transwell实验检测脂肪酸钠盐(FASS)对HUVEC细胞迁移能力的促进作用;4)、体外血管形成实验检测脂肪酸钠盐对HUVEC细胞血管形成的促进作用;5)、ELISA试剂盒检测脂肪酸钠盐促进细胞生长因子的释放作用;6)、免疫荧光检测脂肪酸钠盐对相应目的蛋白在细胞内表达情况的影响;7)、Western blot实验检测脂肪酸钠盐对内皮细胞增殖、迁移和血管形成相关信号通路蛋白表达如:PI3K/AKT、ERK1/2、p38 MAPK、和TGF/Smad3;8)、RT-qPCR检测在脂肪酸钠盐激活相关的信号通路后触发相关下游基因的表达情况。结果:五谷虫脂肪酸提取物的成分鉴定都为中长链脂肪酸且高达77.31%的脂肪酸为不饱和脂肪酸;在体实验时,我们发现局部应用脂肪酸有效的促进了急性皮肤创面的愈合,组织形态学结果表明脂肪酸有效的促进了创面处的血管形成且细胞增殖活跃;在体外实验中,我们发现脂肪酸钠盐有效的促进了血管内皮细胞增殖、迁移以及血管形成作用,并且明显的提高了促血管形成的细胞生长因子VGEFA、PDGF、TGF-β的释放,提高了与新生血管稳定性相关的蛋白CD31、α-SMA表达,并且有效的激活了AKT、ERK1/2、p38 MAPK、TGF-β/Smads等促进细胞增殖、迁移和促进血管形成相关的信号通路以及下游相关基因(Bcl-2、c-Myc、Bad、p53)的表达。结论:五谷虫干粉脂肪酸提取物有效的增加了皮肤创面的血管形成,进而促进创面的愈合,这种作用主要是通过促进细胞生长因子VGEFA、PDGF、TGF-β的释放,并激活AKT、ERK1/2、p38 MAPK、TGF-β/Smads等促进细胞增殖、迁移和促进血管形成相关的信号通路而实现的。同时,脂肪酸还增加了稳定新生血管的蛋白CD31和α-SMA的表达。总言之,中药五谷虫干粉脂肪酸在促进皮肤愈合中有一定的药用研究和开发价值。
【学位单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图 1 脂肪酸经 GC-MS 鉴定，其 TIC 图，各组分的波峰图及保留时间。图 2 脂肪酸钠盐对 HUVEC 细胞的药效及促进生长作用。 A：CCK-8 实验检测FASS 的药效，B：血细胞计数检测 FASS 促细胞增殖，与 control 组对比，*p< 0.05，** p< 0.01。3. 脂肪酸钠盐对 HUVEC 细胞促迁移作用

16图 2 脂肪酸钠盐对 HUVEC 细胞的药效及促进生长作用。 A：CCK-8 实验检测FASS 的药效，B：血细胞计数检测 FASS 促细胞增殖，与 control 组对比，*p< 0.05，** p< 0.01。3. 脂肪酸钠盐对 HUVEC 细胞促迁移作用应用 Transwell 实验和划痕实验检测 FASS 对 HUVEC 细胞的促迁移作用，结果如图 3 所示。如图 3A、B 所示，FASS 明显促进了 HUVEC 细胞的迁移，且呈现浓度依赖作用。图 3C、D 所示，FASS 明显促进了 HUVEC 细胞从上室膜迁移到下室膜，且细胞数目随 FASS 浓度增加逐渐增多。

图 3 脂肪酸钠盐对 HUVEC 细胞的迁移能力影响。A：划痕实验显示 FASS 促细胞迁移，B：数据统计显示各浓度的促迁移率，C：Transwell 实验显示迁移到膜下的细胞数目，D：数据统计显示迁移的平均细胞数目。与 control 组对比，*p< 0.05，** p< 0.01。4. 脂肪酸钠盐体外促进血管形成脂肪酸钠盐促进 HUVEC 细胞在体外形成管腔作用，我们应用 Matrigel 胶检测细胞形成管腔情况，如图 4 所示。图 4A 显示，随着 FASS 浓度的递增，HUVEC 细胞在体外形成管腔程度越好，表明 FASS 明显促进了内皮细胞的成管作用；图 4 B 所示，利用 ImageJ 软件分析血管形成图可知，统计血管长度、血管分支长度和血管节点数等参数显示，FASS 明显促进了各数值得增加。5. 脂肪酸钠盐促进细胞因子的释放利用 ELISA 试剂盒检测 FASS 促进细胞因子 VEGFA、PDGF 的释放。在 FASS 作用后，细胞因子 VEGFA、PDGF 的释放量如图 5 所示。FASS 明显促进了 VEGFA

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本文编号：2834164