左归丸调控Orexhi及其受体对骨代谢影响的分子机制研究

发布时间：2020-10-09 19:59

　　目的:探讨左归丸(ZGW)“补肾益髓、充脑壮骨”治疗绝经后骨质疏松症(PMOP)的分子机制之一是通过对食欲素(Orexin-A)及其受体1(OX1R)和受体2(OX2R)的调节。方法:实验1:制作ZGW冻干粉使用50%甲醇溶液配制200 mg/ml的ZGW提取液,通过高效液相-质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)对ZGW提取液的化合物图谱进行分析,结合标准品比对ZGW中的化合物成分,并进行含量计算。实验2:采用去卵巢法建立PMOP大鼠模型将50只4月龄雌性SPF级SD大鼠随机分为模型组(OVX)、假手术组(Sham)、雌二醇组(50 μg/kg/d,OVX-E2)、ZGW低剂量组[2.3 g/kg/d冻干粉,OVX-ZGW(L)]和ZGW高剂量组[4.6 g/kg/d冻干粉,OVX-ZGW(H)]。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清骨转换标志物;HE染色观察左侧股骨远端组织病理学变化;显微CT对右侧股骨远端骨密度和骨小梁微结构进行测量和分析;实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测海马组织中食欲素A(Orexin-A)、食欲素受体1(OX1R),食欲素受体2(OX2R)和胫骨组织中Orexin-A、OX1R,OX2R,骨保护素(OPG)和核因子κB受体激活因子配体(RANKL)mRNA和蛋白表达水平。实验3:ZGW含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向OB方向分化的影响制备ZGW含药血清,设置10%DMEM组(Control),2.5%ZGW含药血清-7.5%DMEM组(ZC),成骨诱导液组(OS),2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组(ZCS)。通过MTT法观察各组对BMSCs增殖的影响;碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向OB方向的分化,碱性磷酸酶(AKP)法检测细胞培养液中AKP的含量,qPCR法检测Orexin-A、OX1R、OX2R、RUNX2、OPG和RANKL mRNA的表达,Western blot检测BMSCs中RUNX2、RANKL和OPG蛋白的变表达。实验4:拮抗剂对ZC干预BMSCs向OB方向诱导分化的影响MTT法检测OX1R拮抗剂、OX2R拮抗剂和OX1R/OX2R双重拮抗剂在200 μmol/L,100 μmol/L,10μmol/L,1μmol/L,100 nmol/L等浓度条件下对BMSCs的毒性影响。设置Control,ZC,ZCS,ZCS-10μmol/L OX1R拮抗剂组(OX1R10),ZCS-1μmol/LOX1R拮抗剂组(OX1R1),ZCS-100 nmol/LOX1R拮抗剂组(OX1R01),ZCS-10μmol/L OX2R拮抗剂组(OX2R10),ZCS-1 μmol/LOX2R拮抗剂组(OX2R1),ZCS-100 nmol/L OX2R拮抗剂组(OX2R01),ZCS-10 μmol/L OX1R/OX2R双重拮抗剂组(OX1R2R10),ZCS-1 μmol/L OX1R/OX2R 双重拮抗剂组(OX1R2R1),ZCS-100 nmol/L OX1R/OX2R双重拮抗剂组(OX1R2R01),碱性磷酸酶法检测细胞培养液中AKP的含量,碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向OB方向的分化,Western blot检测BMSCs中RUNX2、RANKL和OPG蛋白的变化。结果:1.经与标准品比对,UHPLC-MS/MS共检测出ZGW提取液1 1种化合物,分别为马钱苷、莫诺苷、金丝桃苷、槲皮素、胡萝卜苷、蜕皮甾酮、芦丁、山奈酚、梓醇、薯蓣苷元、獐牙菜甙,含量为0.036‰、0.06‰、0.041‰、0.014‰、0.081‰、0.092‰、0.066‰、0.013‰、0.066‰、0.046‰和0.056‰。2.与Sham相比,大鼠卵巢摘除2个月后,大鼠体重显著升高(P0.05),其血清中骨吸收标记物Ⅰ型胶原交联羧基端肽(β-CTX)和抗酒石酸碱性磷酸酶b(TRAP5b)明显升高(P0.01),骨形成标记物骨碱性磷酸酶(BALP)和骨保护素(OPG)水平显著下降(P0.01),BMD水平明显降低(P0.01),骨小梁变薄、分离度增宽、顺序排列紊乱、骨小梁断裂和骨空泡增多,股骨强度变弱股骨显微结构破坏严重。此外,OVX组大鼠海马OX1R和胫骨OX2R、RANKL mRNA和蛋白表达水平较Sham明显升高(P0.05,P0.01),而胫骨Orexin-A、OPG、OX2R和脑中Orexin-A、OX2R mRNA和蛋白表达水平显著下降(P0.05,P0.01)。与OVX组相比,给药1个月后,OVX-ZGW(L)和OVX-ZGW(H)组对大鼠体重无明显影响(P0.05),给药3个月后,OVX-ZGW(L)、OVX-ZGW(H)和OVX-E2组大鼠体重显著降低(P0.01)。同时,ZGW显著提高去卵巢大鼠血清中骨形成标记物BALP和OPG水平(P0.01),抑制骨吸收标记物β-CTX)和TRAP5b水平(P0.01),增强骨小梁数量,减少骨空泡和骨小梁分离度,改善骨密度和骨显微结构水平,增强骨强度(P0.01)。此外,ZGW下调去卵巢大鼠中枢和胫骨中OX1R和RANKL mRNA和蛋白的表达,上调中枢中Orexin-A mRNA,OX2R mRNA和蛋白以及外周骨中Orexin-A、OX2R和OPG mRNA或蛋白的表达水平(P0.01),但对中枢中Orexin-A的作用并不明显(P0.05)。3.与Control组相比,MTT法显示ZC对BMSCs的增殖能力作用有限(P0.05),碱性磷酸酶法显示ZGW含药血清培养后的培养液中AKP含量无明显变化(P0.05),碱性磷酸酶钙钴发染色显示ZC组只有少量细胞核呈紫蓝色,对BMSCs细胞中Orexin-A、OX1R、OX2R、RUNX2、OPG和RANKL mRNA和蛋白无明显影响(P0.05)。与OS组相比,ZCS中的有大量细胞核呈紫蓝色,AKP含量明显升高(P0.01),BMSCs中Orexin-A、OX2R、RUNX2和OPG mRNA和蛋白表达明显上调(P0.05,P0.01),RANKL和OX1R mRNA和蛋白表达明显下降(P0.05,P0.01)。4.MTT法检测显示OX1R拮抗剂、OX2R拮抗剂和OX1R/OX2R双重拮抗剂对BMSCs毒性影响最小的浓度范围在10μmol/L,1μmol/L,100 nmol/L。与ZCS组相比,在孵育3天后,OX1R10组的AKP含量未见明显变化(P0.05),OX2R10和OX1R2R10组的AKP含量明显下降(P0.01);在孵育7天后,与ZCS组相比,OX1R10和OX1R2R10组的AKP含量明显升高(P0.01),OX2R10组的AKP含量明显下降(P0.05)。碱性磷酸酶钙钴染色结果显示:与OS组相比,加入ZGW含药血清后,BMSCs中的染色明显较深;与ZCS组比较,OX1R10,OX1R1和OX1R01组的染色明显变深,且OX1R10组颜色最深;OX2R10组,OX2R1组,OX2R01组染色明显变浅,且OX2R10组颜色最浅;OX1R2R10组,OX1R2R1组,OX1R2R01组颜色变浅更为明显,且OX1R2R10组颜色最浅。与ZCS组相比,OX1R10和OX1R1组中RUNX2和OPG蛋白表达显著上升,而RANKL蛋白明显下降(P0.05,P0.01);而OX1R01组中的RUNX2、OPG和RANKL蛋白表达没有统计学意义(P0.05)。与OX1R10组相比,OX1R1组和OX1R01组中RUNX2和OPG蛋白表达显著下降,而RANKL蛋白则明显上升(P0.01);与ZCS组相比,OX2R10组和OX2R1组中的RUNX2和OPG蛋白表达显著下调,而RANKL蛋白则明显上升(P0.05,P0.01);OX2R01组中的RUNX2和OPG蛋白表达无明显差异(P0.05),而RANKL蛋白表达显著上调(P0.01);与OX2R10组相比,OX2R1组和OX2R01组中RUNX2和OPG蛋白表达明显上调,而RANKL蛋白则显著下降(P0.01);与ZCS组相比,OX1R2R10组和OX1R2R1组中的RUNX2和OPG蛋白表达明显下调,而RANKL蛋白显著上升(P0.05,P0.01);而OX1R2R01组中的RUNX2蛋白表达没有统计学意义(P0.05),而OPG和RANKL蛋白表达明显上调(P0.05,P0.01);与OX1R2R10组相比,OX1R2R01组中的RUNX2和OPG蛋白表达显著上调,RANKL蛋白明显下降(P0.05,P0.01),而OX1R2R1组中的RUNX2蛋白表达则显著上调,RANKL蛋白则明显下降(P0.05,P0.01),但OPG蛋白表达没有统计学意义(P0.05)。结论:1.马钱苷、莫诺苷、金丝桃苷、槲皮素、胡萝卜苷、蜕皮甾酮、芦丁、山奈酚、梓醇、薯蓣苷元、獐牙菜甙11种化合物成分可作为ZGW治疗PMOP有效成分的质量控制标准之一。2.左归丸可双向调节去卵巢大鼠血清中骨吸收和骨形成标记物,提高骨小梁数量,减少骨空泡数量和骨小梁分离度,改善骨密度和骨显微结构水平,增强骨强度,同时左归丸可下调去卵巢大鼠中枢中OX1R和骨中RANKL的表达,上调中枢中Orexin-A和OX2R和外周骨中Orexin-A、OX2R和OPG mRNA和蛋白表达水平。3.单独使用ZGW含药血清,其对BMSCs的增殖及向OB方向分化的能力不明显,但是联合成骨诱导液后,其向OB方向分化的诱导能力显著提高,效果优于单独使用左归丸含药血清或成骨诱导液。4.OX1R拮抗剂对ZGW-成骨诱导液干预BMSCs的增殖、向OB方向诱导分化具有促进作用,而OX2R拮抗剂或OX1R/OX2R双重拮抗剂对ZCS干预BMSCs的增殖和向OB方向诱导分化具有抑制作用。5.ZGW能够改善围绝经期综合症,并且促进骨形成、抑制骨吸收、增加骨量、提高骨强度以及改善骨小梁显微结构水平的分子机制之一可能与对Orexin-A及其OX1R和OX2R受体的调节有关。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

流程图,流程,煎煮液,烊化

南京中医药大学博士学位论文的水煎煮１邋ｈ，为第二次煎煮液。逡逑（３）将两次煎煮液混合，过滤后进行浓缩，浓缩到５０００邋ｍｌ时加龟板胶（２４０邋ｇ）角胶（２４０邋ｇ）进行烊化。逡逑（４）将２５０邋ｍｌ的浓缩液加入专用冷冻干燥瓶内，液氮迅速冷冻，上Ｆｒｅｅｚｅ邋Ｄｒｙｅｒｓ机－５０邋°Ｃ干燥。逡逑（５邋）邋４８ｈ取下冻干粉，粉碎后低温干燥保存，得药率为４９．５％邋（图１－１）。逡逑

色谱,甲醇提取物,冻干粉,色谱

图１－２邋ＺＧＷ冻干粉５０％甲醇提取物的正（Ａ）负（Ｂ）离子总离子色谱（ＴＩＣ）逡逑表１－２邋ＺＧＷ中主要检测的化合物成分和含量逦逡逑序号逦化学名称逦分子化学式逦分子量邋时间（ｍｉｎ）邋含量（９６。）逡逑１逦马钱苷逦Ｃ１７Ｈ２６0ｉ０逦３９０．３８逦２．８７逦０．０３６逡逑２逦金丝桃苷逦Ｃ２１Ｈ２0０１２逦４６４．３７６３逦２．９２逦０．０４１逡逑３逦蜕皮甾酮逦Ｃ２７Ｈ４４0７逦４８０．６３逦３．０１逦０．０９２逡逑４逦胡萝卜甾醇逦Ｃ３５Ｈ６０Ｏ６逦５７６．８５逦３．０５逦０．０８１逡逑５逦莫诺苷逦Ｃ１７Ｈ２６0ｕ逦４０６．３８１７逦３．２７逦０．０６逡逑６逦蜕皮甾酮逦５２０．６５逦３．５逦０．０２３逡逑７逦芦丁逦Ｃ２７Ｈ３０Ｏ１６逦６１０．５１逦３．７４逦０．０６６逡逑８逦胡萝卜甾醇逦Ｃ３５Ｈ６Ｑ０６逦５７６．８５逦３．８１逦０．０７逡逑９逦山奈酚逦Ｃ１５Ｈ１０Ｏ６逦２８６．２３逦４．７逦０．００６逡逑１０逦山奈酚逦Ｃ１５Ｈ１０Ｏ６逦２８６．２３逦４．７８逦０．０１３逡逑１１逦梓醇逦Ｃ１５Ｈ２２Ｏ１０逦３６２．３３逦６．７逦０．０６６逡逑

区域图,骨密度,显微结构,区域

图２－２显微ＣＴ检测的局部骨密度和骨显微结构区立逡逑邋中打开邋Ｃｕｓｔｏｍ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，点邋Ｂａｔｃｈ邋ｍａｎｇｅｒ邋进行邋Ｔａｓｋ邋ｌｉｓｔ邋各项参数：Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ，邋ｌｏｗ：邋１１０，ｈｉｇｈ：ｌａｔｉｏｎ，３Ｄ邋ｓｐａｃｅ，Ｋｅｎｅｌ：邋Ｒｏｕｎｄ，邋Ｒａｄｉｕｓ邋１０，邋Ａｐｐｌｙ邋ｔｏ：ｇｉｃａｌ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｔｙｐｅ：邋Ｄｉｌａｔｉｏｎ，邋２Ｄ邋ｓｐａｃｅ，邋Ｋｅｎｅｌ：ｏｆ邋ｉｎｔｅｒｅｓｔ；邋３Ｄ邋ｍｏｄｅｌ，邋Ａｐｐｌｙ邋ｔｏ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＲＯＩ，邋ＤｏｕＲＯＩ文件图片添加到Ｂａｔｃｈ邋ｍａｎｇｅｒ中进行处理，图在ＣＴｖｏｌ软件中处理，根据需要进行旋转调整，骨强度逡逑检测，将右侧股骨从－８０邋°Ｃ冰箱取出，放４°Ｃ冷库，并对准载荷头；股骨两端髌骨面朝上放置于两点支

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