丹参中丹参酮提取工艺优化及活性研究

发布时间：2020-10-09 19:50

　　本文采用乙醇回流法及超临界CO_2提取法对丹参中丹参酮的提取工艺进行优化,结合单因素和正交实验,得出乙醇回流法最佳工艺条件为料液比1:8,温度70℃,浸泡时间1h,回流时间2h,最高丹参总酮提取率达3.12%。超临界CO_2提取法最佳工艺条件为压力35Mpa,温度45℃,时间2h,夹带剂流速1.0mL/min,丹参总酮的最高提取率达4.58%。相比之下,超临界CO_2提取法的提取效率更高。通过液质联用法(LC-MS)对丹参粗提物进行成分分析,鉴定出丹参提取物中的4种主要成分分别为丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮和二氢丹参酮,根据建立的4种丹参酮标准曲线,计算出每种成分的具体含量。结果显示,丹参酮提取率总体表现为丹参酮IIA隐丹参酮丹参酮I二氢丹参酮。采用了AKTA纯化系统对丹参粗提取物进行进一步的分离。分离后各组分经薄层色谱法(TLC)及高效液相色谱(HPLC)鉴定,结果表明四种主要丹参酮成分均被较好的分离开来,HPLC检测出四种丹参酮纯度分别为:丹参酮IIA:96.685%、丹参酮I:93.083%、隐丹参酮:94.968%、二氢丹参酮:99.621%。丹参酮的理化活性研究具体包含抑菌活性及抗癌活性两大方面,在抑菌实验中,CFU实验结果表明四种丹参酮均表现出不同程度的抑菌效果,其中隐丹参酮的抑菌能力最强,其次为二氢丹参酮和丹参酮I,丹参酮ⅡA的抑菌效果最弱。MIC实验更进一步证实了隐丹参酮具有出色的抑菌能力,其中对金黄色葡萄球菌的MIC值为20±0.08μg/mL,对大肠杆菌的MIC值为15±0.03μg/mL。经扫描电镜(SEM)观察,发现隐丹参酮可破坏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜,造成细菌的生长、繁殖功能障碍,最终导致细菌死亡。实验选用丹参中含量最高的活性成分丹参酮IIA作为抗癌活性研究对象,由于其自身水溶性较差,无法直接作用于正常肿瘤细胞,因此采用表面活性剂泊洛沙姆188对丹参酮IIA进行包裹,制成固体分散体,后经SEM表征及溶解度测试实验,证明丹参酮IIA-P188-SD的水溶性是普通丹参酮ⅡA标品的5倍。抗癌活性实验中,采用不同浓度梯度的丹参酮IIA-P188-SD处理人胃癌细胞7901,经过LIVE/DEAD实验验证和流式细胞仪检测,证明丹参酮IIA-P188具有抑制癌细胞生长的作用,且抗癌活性随药物浓度上升而提高。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284.2;R285
【部分图文】：

色谱,丹参提取物,丹参酮,液相色谱图

4 结果与分析4.1 丹参提取物的化学成分分析4.1.1 LC-MS 检测结果通过 HPLC 外标法鉴定，丹参提取物的色谱结果如图 1 所示，质谱检测结果见图2：

质谱检测,丹参酮Ⅰ,丹参酮ⅡA,隐丹参酮

丹参酮ⅡA：27.3min。保留时间均与图 1A 中相应成分相对应，因此对这四种物质的鉴定结果有了初步的判断，根据图 2 质谱检测结果，确定这四种物质的相对分子质量，图2A、B、C、D的最大离子碎片分别为m/z 277、297、277、295，与二氢丹参酮（M=276）、隐丹参酮（M=296）、丹参酮Ⅰ（M=276）、丹参酮ⅡA（M=294）的相对分子质量相对应，因此结合图 1 和图 2 可确定这 4 个峰分别为二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ以及丹参酮ⅡA；根据峰面积比对结果显示，丹参酮ⅡA（31.6%）、丹参酮Ⅰ（11.6%）、隐丹参酮（15.5%）、二氢丹参酮（7.2%）这四种成分峰面积之和占总峰面积比的65.9%,因此确定二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA 为丹参提取物中的主要成分。

标准曲线,丹参酮,标准曲线,丹参酮Ⅰ

图 3 丹参酮标准曲线Figure 3 The standard curve of tanshinone以溶液浓度为横坐标 X，色谱峰面积为纵坐标 Y，绘制标准曲线，如图 3 所示四种丹参酮的标准曲线分别为：丹参酮ⅡA：y=77486x-5633，R2=0.997；丹参酮Ⅰ：y=27350x-917.4，R2=0.996；隐丹参酮：y=27381x-775.4，R2=0.998；二氢丹参酮：y=35934x-144.9，R2=0.998。4.1.2 精密度实验精密度实验结果如表3所示，丹参酮ⅡA的RSD为0.50%，丹参酮ⅠRSD为0.99隐丹参酮 RSD 为 0.72%，二氢丹参酮 RSD 为 0.76%，RSD 值＜2%，说明仪器精密度良好。

【参考文献】