柘树果实活性成分Warangalone诱导宫颈癌细胞凋亡的分子机制研究

发布时间：2020-10-12 18:06

　　 目的:宫颈癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤之一,在女性肿瘤中的发病率仅次于乳腺癌,而现有的抗肿瘤药物仍然存在毒性大、疗效较低等弊端,因此开发一种疗效好且毒副作用小的抗宫颈癌药物具有非常重要的意义。一直以来植物天然产物在开发新的治疗恶性肿瘤药物中一直占有重要的地位,Warangalone为柘树果实(Fructus Maclurae Tricuspidatae)中分离得到的异黄酮类化合物,前期研究发现其具有较好的抗氧化活性,且对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7具有较好的抑制作用,但对其抑制肿瘤细胞的分子机制并不清楚。因此,我们从柘树果实中提取、分离、纯化得到Warangalone,然后通过体外对多种肿瘤细胞筛选,最后选用对Warangalone较为敏感的宫颈癌细胞系He La作为研究对象来探讨Warangalone的抗肿瘤作用及其分子机制。方法:1.柘树果实活性成分Warangalone的提取分离及结构鉴定以柘树果实为原材料,甲醇作为溶剂浸提;乙酸乙酯萃取;采用硅胶柱和Sephadex LH-20层析柱等方法对乙酸乙酯部位进行分离纯化;通过NMR,MS,X单晶衍射对获得的化合物进行结构鉴定。2.Warangalone体外抗肿瘤作用机制研究采用MTT法检测Warangalone对人宫颈癌细胞Si Ha、Caski、He La,人肝癌细胞Hep G2,人乳腺癌细胞M321和MCF-7,人正常肝细胞LO2,人正常脑胶质细胞chem-5共8种细胞增殖的抑制作用,并计算出半抑制浓度IC50。最终选择对Warangalone最为敏感的He La细胞作为研究对象,以不同浓度(0μM、10μM、20μM、30μM)的Warangalone作用不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h)处理He La细胞,测定其抑制肿瘤细胞增殖的剂量和时效关系;光学显微镜观察Warangalone对细胞形态的影响;Hochest 3342染色观察其对细胞核凋亡形态的影响;细胞划痕实验和Transwell法检测其对细胞侵袭能力的影响;PI单染检测其对细胞周期分布的影响;Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;JC-1染色检测其对线粒体膜电位的影响;DCFH-DA荧光探针法检测细胞的ROS水平;Western blot测定Warangalone对He La细胞信号凋亡通路Bcl-2家族、Caspase家族、细胞色素C、PARP的和MAPK信号通路相关蛋白的表达表达水平的影响。结果:1.分离纯化得到三个异黄酮晶体化合物:其中一个化合物是目标化合物Warangalone另外两个化合物分别是4'-O-Methylalpinumisoflavone和Alpinumisoflavone。2.Warangalone选择性的抑制肿瘤细胞,且对宫颈癌细胞He La的抑制作用最为明显。经Warangalone处理后的He La细胞皱缩,透光度增加,贴壁下降,并且呈时间-剂量依赖性;Hochest 3342染色及流式细胞术检测细胞周期凋亡结果显示He La细胞核发生固缩,加药后细胞凋亡峰Sub G1比率随浓度的逐渐升高而增加;细胞划痕实验和Transwell实验结果显示Warangalone显著的抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。3.经Warangalone处理后的He La细胞发生凋亡,线粒体膜电位显著下降,细胞内活性氧(ROS)累积,且He La细胞发生凋亡的比例与药物作用浓度呈剂量关系,表明Warangalone可显著诱导宫颈癌细胞He La的凋亡。4.Warangalone主要通过调节线粒体凋亡途径和MAPK信号通路的相关蛋白的表达来诱导宫颈癌细胞凋亡:通过caspase家族蛋白活性检测和Western bloting检测来对其凋亡通路进行判断,结果表明Warangalone主要通过影响Bcl-2家族蛋白的表达,上调Bax、Bad的表达,下调Bcl-2、Bcl-XL的表达,诱导线粒体内的细胞色素C的释放,活化caspase-9、caspase-3,最终PARP被切割而诱导He La细胞凋亡;进一步检测Warangalone对p53和MAPK信号通路相关蛋白表达的影响发现Warangalone能够激活p53,抑制MAPK信号通路中ERK蛋白的磷酸化,增加p38的磷酸化水平,但对AKT和JNK无显著影响。结论:Warangalone具有抗宫颈癌细胞He La活性,其凋亡通路为:Warangalone刺激He La细胞后引起细胞的ROS积累,引起细胞的氧化损伤,导致p53和MAPK家族信号通路的激活,进而调控Bcl-2家族的表达,通过线粒体途径介导细胞凋亡,最终激活凋亡执行蛋白caspase-3,引发He La细胞的凋亡。
【学位单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：

1-3 异黄酮类化合物基本骨架结构(A)；具有抗肿瘤生物活性异黄酮的化 the matrix structure of isoflavone (A); the structure of isoflavones with antitu雌激素作用于异黄酮在结构上与人体的雌性激素相似，因此一些异黄酮表现物活性，能够降低与雌激素有关的肿瘤发生率，主要通过以下几：（1）竞争性的与雌激素受体（ER）结合。Mense 等的研究发黄酮可通过与哺乳动物体内的雌二醇竞争雌激素受体，来减弱雌殖的作用[28]；（2）增加性激素结合球蛋白（SHBG）的合成。料木素对绝经期女性进行干预实验，发现其能够提高绝经妇女的白来降低血液中雌激素的水平[29]；（3）调节催乳素。研究发现通过调节催乳素的分泌来预防和治疗与其分泌相关的肿瘤如乳腺

暨南大学硕士学位论文则通过抑制和促进半胱天冬酶的级联反应来调控细胞凋亡[53]。研究表明异黄酮类物质可通过线粒体途径诱导宫颈癌细胞凋亡。Lo 等研究发现黄豆苷元的主要次级代谢产物 3,4,7-Trihydroxyisoflavone 可通过增加 ROS 水平，激活 p53 通路，进一步引起线粒体内源途径相关蛋白 Bax、Bcl-2 和 caspase-9 上调，最终激活caspase 级联反应诱导宫颈癌细胞 HeLa 凋亡[54]。Zhang 等研究发现大豆苷元通过上调 Bax 基因、下调 Bcl-2 家族基因来促进宫颈癌细胞 HeLa 凋亡。

暨南大学硕士学位论文3.2 Warangalone 抗宫颈癌细胞 HeLa 的分子机制研究从柘果中分离纯化的 Warangalone，通过高效液相进行纯度检测，检测结果显示纯度达到 95.8%,液相图谱如图 3-4 所示。实验开展前将称取 30 mg 的Warangalone，用 3 mL 的 DMSO 溶解配成 10 mg/mL 的储存液 4℃保存，用于后续实验。
【参考文献】

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本文编号：2838095