五味子药材的质量标志物（Q-Marker）研究

发布时间：2020-10-13 14:57

　　 目的:1.通过对五味子本草文献的梳理与考证,制定中华中医药学会“北五味”的道地药材标准草案。2.通过对五味子药材的化学成分的研究,为五味子药材的质量控制与质量评价提供参考,建立五味子药材的化学质量标志物。3.通过分子鉴定,对五味子及近缘物种进行鉴定研究,确立五味子特有的生物学质量标志物。4.通过对五味子药材的显微组织和粉末的观察,对五味子及南五味子的显微特征进行比较与分析,建立五味子药材的形态学质量标志物。并制定2020版《中国药典》的南五味子显微鉴定标准草案。材料与方法:1.材料:2016-2017年收集于辽宁、吉林、黑龙江等三省的五味子药材十批,陕西、河南、湖北、山西等南五味子12批;2016-2017年从辽宁凤城移栽五味子100余株、陕西商洛移栽南五味子50余株、从湖南省怀化市移栽黑老虎20余株到辽宁省中药药用植物重点物种保存圃(辽宁,大连)。2.方法:2.1查阅有关五味子的历史文献50余篇,运用比较分析的方法对五味子的药用历史进行了梳理。2.2运用HPLC和UPLC-MS两种方法对五味子的化学成分进行了分析,对五味子药材的6种木脂素类成分进行定性与定量分析,比较南北五味子6种木脂素类成分的含量差异。2.3五味子的分子生药学分析方法2.3.1运用Illumina Hiseq平台,使用了高通量测序的方法,对南北五味子药材混合粉末的总DNA进行提取、扩增、纯化、制备文库、测序,运用Agilent Bioanalyzer对数据进行检测,最后对测序数据结果进行分析。2.3.2运用Illumina Hiseq平台,使用二代测序和三代测序技术,对五味子、南五味子、黑老虎等三种植物的新鲜叶片的叶绿体基因组DNA进行提取、收集、片段化、建库、扩增、测序、数据检测,最后对数据进行SSR、IR、系统进化分析。2.3.3运用基因组Survey技术评估五味子核基因的大小、GC含量与杂合度,分析实验结果,为全基因组de novo测序提供依据。2.4运用显微镜检技术,按照药典技术指导原则对南北五味子药材组织(石蜡切片)和粉末(水合氯醛和稀甘油装片)进行研究,并显微镜下观察、测量、拍照记录。结果:1.经过本草文献梳理与考证,五味子始载于《神农本草经》,列为上品。明朝《本草原始》始载“辽五味鲜红色,久黑色”,李时珍最早划分南北五味子,并指出“入滋补药必用北产者良”。本课题组长期观察的到南北五味子均具有“析霜”现象,并南五味子更加明显。2.HPLC共测定五味子药材10批,南五味子药材12批,木脂素类成分含量结果显示。辽宁省抚顺的五味子总木脂素含量最高,为19.45 mg/g;辽宁省凤城和桓仁地区的木脂素含量较高,五味子总木脂素的平均含量在15 mg/g左右;UPLC-MS测定结果为显微化学成分的分析提供了基础。3.运用高通量测序对南北五味子药材混合粉末的ITS2序列进行了分析研究,结果得到37601条ITS2序列,划分为196个OTU,并成功分析出南北五味子各自的OTU代表序列,由此成功鉴定出南北五味子药材;对五味子、南五味子、黑老虎三种植物的叶绿体基因组测序得到三者的叶绿体基因组全长分别为146875 bp、146842 bp、145399 bp。对叶绿体基因进行了注释并对物种间的基因差异进行了比较,得到14种叶绿体内的功能基因,并找出了三者之间的差别,IR区边界分析得到三者的rps16和petB和rpl16和clpP等基因的长度和距离边界的位置的区别,SSR的核苷酸类别及数量等信息都可以表明三者物种间的差异等;核基因Survey杂合度的评估结果得到50Gb的基因数据,我们推算五味子的核基因大小约9 Gb,为之后五味子核基因de novo测序奠定了基础。4.通过显微鉴定分析,我们得到南北五味子药材的共同特征有相同结构的种皮表皮石细胞、种皮内层石细胞,不同点在于南五味子在中果皮细胞中含有簇晶方晶,五味子没有,五味子的果皮表皮细胞的垂周壁呈连珠状增厚,南五味子不明显,由这些特点我们可以用来鉴定两者,并制定了2020版《中国药典》南五味子的显微标准草案。结论:1.梳理了五味子的药用历史,制定了道地药材“北五味”的团体标准草案,为五味子栽培和开发等产业的良好发展提供了依据,也为“辽五味”的道地药材的标准制定提供了参考。2.五味子的化学成化学质量标志物研究测定了22批南北五味子为五味子木脂素的含量,为五味子的化学质量标志物的测定与五味子药材的质量评价提供理论数据。3.五味子分子鉴定结论3.1高通量测序技术能准确的鉴定南北五味子混合药材粉末,为混合药材粉末的鉴定提供了新思路。3.2首次对南五味子的叶绿体全基因组进行了测序与分析,并将南五味子的叶绿体基因组上传至NCBI(SRX4282569)。运用叶绿体基因组成功鉴定出五味子及近缘物种,为叶绿体作为超级DNA条形码用于鉴定分析近缘药用植物提供了参考。3.3首次对五味子核基因Survey分析,得到了五味子的基因大小在9 Gb左右,为后续五味子的核基因测序提供了参考。4.南北五味子的显微结构分析得到,两者可通过果皮表皮细胞是否有连珠状增厚和是否含有簇晶方晶鉴定,首次为2020版《中国药典》制定出了南五味子的显微鉴定标准草案。
【学位单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：

A B C图 2-1 古籍中的五味子特征图A 《本草图经 》B 《植物实名图考》C 《本草原始》1.3 五味子的产地变迁与历代品质评价《名医别录》中记载了五味子的产地，“生齐山山谷及代郡。八月采实，阴第一出高丽”，高丽为高句丽，为今东北地区和朝鲜地区，具体包括辽宁全部地林东部和黑龙江南部少部分地区。《本草经集注》：“今第一出高丽，.........次冀州，......又有建平者”。其中青州在汉代时为山东淄博一带地区，冀州为河北建平在汉代时期，为建平郡，复称武陵郡，为今湖南省、湖北省、贵州省、重庆西壮族自治区境。应属今南五味的产区。《本草衍义》：“今华州之西至秦州皆华州和秦州为现今陕西地区，《本草原始》：“辽五味子鲜红色，久黑色”。是最早的记载。《本草乘雅半偈》：“高丽者最胜，河中(山西)府者岁贡，杭越间亦

图 2-2 析霜特征图A、辽五味(辽宁凤城) B、南五味子(陕西商洛)讨 论经过本草文献梳理与考证，我们发现五味子在历史中记载的名称既有北五味如五梅子，又有南五味如山花椒；五味子的产区考证明确了五味子的地道产区在东北靠近朝鲜的一带区域，并且在历史长河中，北五味一直有“第一”“最佳”等记载。五味子的采收加工也是非常重要的步骤，五味子具有良好的保健功效，并且没有任何毒性，五味子制成的五味子膏等均可以作为平常食用的保健品，传统用药中五味子蜜制较多，2015 版《中国药典》收录的炮制方法有醋五味子，也是目前为了五味子保存所

图 3-(1-2) 五味子果实横断面1. 外果皮 2.中果皮 3.维管束 4.内果皮细胞 5.种皮表皮石细胞6.种皮内层石细胞 7.油细胞层 8.种皮内表皮细胞 9.胚乳组织4.2 粉末显微鉴定分析本品粉末红棕色棕至黑棕色。种皮表皮石細胞，一般成片存在，表面观成多角形长多角形；直徑 18-40 μm，纵断面观呈的长方形；长约 40μm，壁厚，孔沟极细密，含棕色物或棕黑色物。种皮内层石细胞，单个散在或附于种皮表皮石细胞层，呈卵圆形长卵圆形、多角形等多种形态。大小不一，长度可达 160 μm，纹孔和孔沟明显。果表皮细胞表面观呈多角形，垂周壁略呈连珠状增厚，表面有角质线纹，表皮中散有油胞。中果皮细胞皱缩，界限不明显，内含淀粉粒。见图 3-3、表 3-2。
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本文编号：2839317