基于Ca等无机元素探讨石膏抗炎作用机制研究

发布时间：2020-10-14 21:55

　　 背景石膏是中药材中清热泻火类药的典型代表,具有辛寒清热、除烦止渴功效,清代医家张锡纯谓其为“清阳明胃腑实热之圣药”。《伤寒杂病论》中载有含石膏方剂18首,石膏与麻黄配伍可辛寒宣肺,石膏与知母配伍可清阳明热,石膏与不同药味配伍发挥功效不同。现代临床中,石膏常被应用于治疗各种炎症免疫相关疾病,如外感高热、肺炎、病毒性心肌炎、类风湿关节炎、银屑病等。石膏善治肺胃气分热盛证,有研究报道称石膏大剂量使用时溶液早已达饱和,增大石膏用量对提高临床疗效无益,然临床上常见不同剂量石膏发挥药效不同,石膏发挥药效物质基础尚不清楚。目的本研究拟从无机元素角度出发,在不同炎症模型下探讨石膏抗炎作用的物质基础与作用机制,为临床更好运用石膏提供依据。方法1.石膏水煎液中无机元素含量测定:运用ICP-MS法检测不同浓度石膏水煎液(240g/40mL,480g/40mL,960g/40mL)中无机元素含量,240g石膏与30g粳米同煎所得水煎液中无机元素含量,30g粳米单独煎煮所得40mL水煎液中无机元素含量;检测的无机元素主要有以下15种:钙Ca、锶Sr、铁Fe、铝Al、镍Ni、锰Mn、铬Cr、铜Cu、锌Zn、砷As、钴Co、硒Se、钛Ti、钾K、镁Mg;比较不同浓度石膏水煎液中无机元素含量差异;比较相同质量石膏情况下,加粳米与不加粳米水煎液中无机元素含量差异。2.在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型下,探讨石膏水煎液抗炎作用:体外培养RAW264.7细胞,CCK8法检测不同浓度石膏水煎液对RAW264.7细胞细胞活力影响,选取对RAW264.7细胞细胞活力无影响石膏水煎液浓度用于后续药效探索。取对数生长期RAW264.7细胞按1X106接种于24孔板,37℃、5%CO2培养箱中培养24h后,加入不同浓度石膏水煎液及LPS溶液(终浓度为1 u g/mL),细胞培养箱中继续培养24h,检测细胞上清液中NO生成量。3.在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型下,探讨石膏、石膏粳米、含水硫酸钙水煎液抗炎作用:不同浓度石膏粳米水煎液、粳米水煎液、含水硫酸钙水煎液干预RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,选取对RAW264.7细胞细胞活力无影响浓度用于后续实验。取对数生长期RAW264.7细胞按1X106接种于24孔板,37℃、5%CO2培养箱中培养24h后,加入不同浓度石膏水煎液/石膏粳米水煎液及LPS溶液(终浓度为1μg/mL),细胞培养箱中继续培养24h,检测细胞上清液中NO生成量。选取最佳石膏水煎液干预浓度(终浓度0.75mg/mL),同时用石膏粳米水煎液(终浓度0.75mg/mL+46.875μ g/mL)、粳米水煎液(终浓度46.875 μ g/mL)、含水硫酸钙水煎液(终浓度0.75mg/mL)干预LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型,检测各组细胞上清液中NO生成量。4.在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型下探讨石膏、石膏粳米、含水硫酸钙水煎液抗炎作用:连续7天于BALB/c小鼠背部涂抹42mg咪喹莫特乳膏,建立银屑病模型,分别用石膏水煎液(36g/kg)、石膏加粳米水煎液(38.25g/kg)、粳米水煎液(2.25g/kg)、含水硫酸钙水煎液(36g/kg)灌胃干预咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠模型7天,实验第8天用PASI评分评价小鼠背部皮损,HE染色观察各给药组对银屑病小鼠皮损病理结构的影响,检测各组小鼠血清中TNF含量,比较各给药组抗炎药效。5.不同浓度石膏水煎液对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠抗炎作用研究:连续7天于BALB/c小鼠背部涂抹42mg咪喹莫特乳膏,建立银屑病模型,不同浓度石膏水煎液(36g/kg,9g/kg)灌胃干预咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠模型7天,实验第8天用PASI评分评价小鼠背部皮损,HE染色观察石膏水煎液对银屑病小鼠皮损病理结构的影响,比较不同浓度石膏水煎液抗炎药效。6.在LPS诱导的小鼠全身炎症反应综合征模型下探讨石膏、含水硫酸钙、石膏粳米水煎液抗炎作用及机制:建立小鼠全身炎症反应综合征模型,实验造模前0.5h予各给药组小鼠灌胃给药地塞米松水溶液(1Omg/kg)、石膏水煎液(36g/kg)、石膏粳米水煎液(38.25g/kg)、粳米水煎液(2.25g/kg)、含水硫酸钙水煎液(36g/kg),4h后予各组小鼠(正常组,LPS模型组,地塞米松组,石膏组,石膏粳米组、粳米组、含水硫酸钙组)眼球取血,检测各组小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6含量。HE染色观察各给药组对小鼠肺组织的影响。RT-PCR检测小鼠肺组织IL-1 β、TNF-α、IL-6基因表达量,western blot 法检测 TLR4、MyD88、IKB α、phospho-NF-κ B p65 蛋白表达量。结果1.石膏水煎液中含有Ca、Mg、Ti、Sr等无机元素。在同一石膏水煎液中,无机元素Ca含量最高,Mg、Ti、Sr等的含量较少。在不同浓度石膏水煎液中,无机元素Ca的浓度在240g-480g/40mL石膏水煎液中呈上升趋势,且Ca浓度与水煎液中石膏质量具有显著相关性(P0.05),而在480g/40mL、960g/40mL的石膏水煎液中Ca元素浓度变化不大;无机元素Ti、Mg的浓度在240g/40mL、480g/40mL、960g/40mL石膏水煎液中无显著变化;无机元素Sr的浓度在240g-960g/40mL石膏水煎液中含量逐渐上升,其浓度与水煎液中石膏质量有显著相关性(P0.05)。石膏与粳米同煎,可增加水煎液中Ca、Mg等元素含量。2.与正常组比较,石膏水煎液在1.5ng/mL-15mg/mL浓度范围内,对RAW264.7细胞细胞活力无显著影响;与LPS模型组比较,15mg/mL、1.5mg/mL石膏水煎液干预LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型,细胞上清液中产生的NO含量显著减少(P0.01)。3.石膏水煎液浓度范围在1.5mg/mL-0.375mg/mL时,LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中NO产生量随给药浓度的减小而增加。与LPS模型比较,石膏粳米水煎液浓度为(1.5mg/mL+93.75 μ g/mL)、(150 μ g/mL+9.375 μ g/mL)、(15 μ g/mL+937.5ng/mL)时,均可显著降低细胞上清液中NO的生成(P0.01)。4.与LPS模型组比较,石膏组、石膏粳米组、含水硫酸钙组、粳米组细胞上清液中NO的生成均显著下降(P0.01);与石膏粳米组比较,石膏组细胞上清液中NO的生成显著增加(P0.01);与含水硫酸钙组比较,石膏组细胞上清液中N0产生量升高(P0.01)。5.石膏水煎液、石膏粳米水煎液、粳米水煎液、含水硫酸钙水煎液均可显著降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠背部皮损PASI评分,其中石膏组与含水硫酸钙组PASI评分差异未见统计学意义;与石膏组比较,石膏粳米组小鼠背部皮损PASI评分显著降低(P0.01);HE染色结果显示:石膏水煎液、石膏粳米水煎液、粳米水煎液、含水硫酸钙水煎液均可使小鼠表皮增厚程度减轻,表皮棘皮症减少,角化过度或角化不全细胞减少,炎症细胞浸润减少,其中石膏粳米组小鼠皮损病理组织改善最为明显,此后依次为石膏组、雷公藤组、含水硫酸钙组、粳米组;血清中促炎因子TNF检测结果示:与正常组比较,模型组小鼠血清中TNF含量显著升高(P0.01);雷公藤组、石膏组、石膏粳米组及含水硫酸钙组小鼠血清中TNF含量较模型组均有不同程度降低(P0.05);各给药组中,石膏粳米组小鼠血清中TNF含量均值最低,此后依次为阳性药雷公藤组、含水硫酸钙组、石膏组、粳米组。6.石膏水煎液可显著降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠背部皮损PASI评分,HE染色显示石膏水煎液可使银屑病小鼠背部皮损增厚程度减轻,表皮棘皮症减少,角化过度或角化不全细胞减少,炎症细胞浸润减少;高剂量石膏水煎液较低剂量石膏水煎液在改善小鼠背部红斑颜色及皮肤浸润肥厚方面效果更明显。7.与LPS模型组比较,地塞米松水溶液、石膏水煎液、石膏粳米水煎液、粳米水煎液、含水硫酸钙水煎液均可不同程度改善小鼠肺组织结构紊乱、炎症细胞浸润程度及显著降低小鼠血清中TNF-α、IL-6含量(P0.01),其中地塞米松组改善作用最明显,此后依次为石膏粳米组、石膏组、含水硫酸钙组、粳米组。8.与LPS模型组比较,石膏水煎液可显著降低LPS诱导的全身炎症反应综合征小鼠肺组织中IL-1 β、TNF-α、IL-6基因表达(P0.05);当石膏与粳米配伍应用时,小鼠肺组织中IL-1 β、TNF-α、IL-6基因表达量较石膏组更低(P0.05);含水硫酸钙可显著降低全身炎症反应综合征小鼠肺组织中TNF-α、IL-6基因表达(P0.01),但对IL-1 β基因的表达影响不大。9.与LPS模型组比较,石膏水煎液、含水硫酸钙水煎液、石膏粳米水煎液均可显著降低TLR4、MyD88、phospho-NF-K B p65蛋白表达(P0.01),同时减少LPS诱导的IKB α蛋白降解(P0.05),然石膏粳米组TLR4/NF-κ B通路蛋白的表达与石膏组比较差异不大。结论1.石膏水煎液中含有Ca、Mg、Ti、Sr等无机元素。2.石膏水煎液对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型、咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型、LPS诱导的全身炎症反应综合征小鼠模型均有一定的抗炎药效,石膏水煎液可能部分通过抑制TLR4/NF-κ B通路激活发挥其抗炎作用。3.石膏水煎液发挥抗炎药效的物质基础有Ca元素,可能含有Mg、Mn元素。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

？ｎｃｒ？｜ｊ？ｉ?（ｐｐｂｊ??ｆ（ｘ）?＝?１１９４．２３３ＣＴＸ?＋?３６．５５５７?ｆ（ｘ）?＝?３０．５１２８＊ｘ?＋?８．３５２７?ｆ（ｘ）?＝?７０００．４８１２＊ｘ?＋?４８６．１０６０??＝?０．９９９８?Ｒ２?＝?０．９９８２?ｌ＾＝?１．００００??ＢＥＣ?＝?０，０３１?ｐｐｂ?ＢＥＣ?＝?０．２７４?ｐｐｂ?ＢＥＣ?＝?０．０６９?ｐｐｂ??ＬｏＤ?＝?０．０４７０?ｐｐｂ?ＬｏＤ?－?０．５７３４?ｐｐｂ?ＬｏＤ?－?０．０２８８?ｐｐｂ??图２?ＩＣＰ－ＭＳ法检测不同无机元素标准曲线图??３．２不同浓度石膏（或粳米）水煎液中无机元素含量??本实验共检测３组不同浓度石膏水煎液中无机元素含量，依次为：２４０ｇ／４０ｍＬ、??４８０ｇ／４０ｍＬ、９６０ｇ／４０ｍＬ，每组设置３个重复；又检测２４０ｇ石膏与３０ｇ粳米同煎所得４０ｍＬ??水煎液无机元素含量，３个重复；３０ｇ粳米单独煎煮所得４０ｍＬ溶液中无机元素含量，２??个重复；各组水煎液中无机元素含量具体见表５。??表５不同浓度石膏（或粳米）水煎液中无机元素含量表??元?素石膏２４０ｇ?石膏４８０ｇ?石膏９６０ｇ?石膏２４０ｇ＋粳米粳米３０ｇ??（ｍｇ／ｋｇ）?３０ｇ??Ｃａ?６１９．６７±６３．５８?７４５．３３±１７．６２?７３８．００±３２．００?１０６２．３３±３１．６６?９．５??Ｋ?－?—?１５８±４３．９２?２００．５??Ｍｇ?６?６±１．７３?３６．３３±４３．?１５?３１±５．５７?２２??Ａ１?２．４１?３．８２?４．７６?－?２．４１??Ｔｉ?１．１３±０．３０?１．１８±０．０

?２〇Ｔ??？?Ｂ－｜???ｆ?｜?ｆ????＂Ｓｉ?ｏｊ?＊ｊ?ｇｑ?Ｉ??ｌ１Ｓ－?Ｉ１５＇?年?Ｉｓ．?ｋｍＪｍｍ??（Ｉ）?０）?ＣＯ?＊??Ｉ－?Ｉ－?ｍｍ?１－?ｒ?ｊ，??丨５＿一＾＾丨儀＿?Ｋ??－?，?，?Ｊ?ｓ?５０Ｕ＾ｅ＿?ｌｌｌｉｌ??２４０?４ｆｉ０?７２０?９６０?ＧＦ－Ｌ?ＧＦＭ?ＧＦ－Ｗ?ＧＦ－Ｌ?ＧＦ＋Ｒ??Ｇｙｐｓｕｍ?ｆ！ｂｒｏｓｕｍ（ｇ）?Ｇｒｏｕｐ?Ｇｒｏｕｐ??图３不同浓度石膏水煎液中无机元素含量对比分析图??注：ＧＦ－Ｌ：石膏低剂量组；ＧＦ－Ｍ：石膏中剂量组；ＧＦ－Ｈ：石膏高剂组。与ＧＦ－Ｌ组比较，Ｙ＜０．０５，??ｗ／＊＜０．?０１；与?ＧＦ－Ｍ?组比较，ＡＰ＜０．?０５。??３．４无机元素Ｃａ、Ｔｉ、Ｓｒ含量与石膏水煎液中生石膏质量相关性分析??运用ｐｅａｒｓｏｎ相关分析法依次分析石膏水煎液中生石膏质量与测得石膏水煎液中??Ｃａ、Ｔｉ、Ｓｒ含量相关性，结果显示石膏水煎液中生石膏质量为２４０ｇ、４８０ｇ时Ｃａ元素含??量变化与石膏质量变化具有相关性（Ｐ＜〇．?０５）；生石膏质量变化与石膏水煎液中Ｔｉ含??量变化无显著相关性；生石膏质量为２４０ｇ、４８０ｇ、９６０ｇ时与石膏水煎液中Ｓｒ含量变化??具有显著相关性（尸＜０．０５）。??表６无机元素Ｃａ、Ｔｉ、Ｓｒ含量与石膏水煎液中生石膏质量相关性分析??元素（ｍｇ／ｋｇ）?石膏２４０ｇ?石膏４８０ｇ?石膏９６０ｇ?Ｐｅａｒｓｏｎ相关性尸值??Ｃａ?６１９．?６７±６３．?５８?７４５．?３３±１７．?６２?－?０．８６?０．０３??６１９．?

?基于Ｃａ等无机元素探讨石膏抗炎作用机制研究???２．０?＊＊??￣ｒ??Ｓ＇??８?Ｐｎ?ｐ］?＾?＾?＾?＾?Ｔ?ｔ??＊１?ｆ）ｌ?—??．Ｉ—ｒ?■?．?Ｖ?．???．??？崖??｜?〇＇５－；；??图４?ＣＣＫ８检测不同浓度石膏水煎液对ＲＡＷ２６４．?７细胞活性的影响??注：与正常组比较，＊Ｘ〇．?０１。??３．?２不同浓度生石膏水煎液对ＬＰＳ诱导的ＲＡＷ２６４．?７细胞上清液中炎症因子ＮＯ产生的影??响??根据３．?１实验结果筛选出生石膏水煎液对ＲＡＷ２６４．?７细胞细胞活力无明显影响浓度??１．?５ｎｇ／ｍＬ－１５ｍｇ／ｍＬ，本实验选择该范围内５个生石膏浓度对ＬＰＳ诱导的炎症反应进行干??预，结果发现与正常组比较，未加生石膏水煎液的ＬＰＳ干预模型组细胞上清液中ＮＯ含??量显著升高，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；与ＬＰＳ模型组比较，１５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ??生石膏水煎液干预ＬＰＳ诱导的细胞炎症反应模型，细胞上清液中产生的ＮＯ含量显著减??少，且差异具有统计学意义（Ｐ＜〇．?０１）；当生石膏水煎液浓度下降至１５０?ｕｇ／ｍＬ、１５??ｕｇ／ｍＬ、１．５?ｕｇ／ｍＬ时，细胞上清液中ＮＯ的生成较ＬＰＳ模型组未见显著性差异，但随着??石膏水煎液浓度的降低，细胞上清液中生成Ｎ０含量有逐渐上升趋势。实验具体结果如??图５所示。??６０??
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本文编号：2841245