新黄芪茯苓复方抗缺氧、抗疲劳效应及对缺氧心肌蛋白表达影响的研究

发布时间：2020-10-14 22:34

　　氧是人体所必需的。组织供氧减少或不能充分利用氧,导致组织代谢、功能和形态结构异常变化的病理过程称为缺氧。正常成人静息时的耗氧量约为250 ml/min,剧烈运动时可增加8-9倍,而人体内储存氧量仅为1500 ml,一旦呼吸心跳停止,数分钟内就可能死于缺氧。缺氧是处在高原、航空、潜水等特殊环境下最普遍的应激因素,也是慢性阻塞性肺病、严重急性呼吸综合征、心肌梗死、缺血性脑卒中、失血性休克、氰化物中毒等多种疾病常见的病理过程,可导致多种疾病发生,影响机体的各种代谢,尤其会影响机体的氧化供能,长期或严重缺氧可导致机体心、脑等重要器官能量供应不足而死亡。疲劳,又称疲乏,是一种主观不适感。客观上在同等条件下,失去其完成原来所从事的正常活动或工作能力,且疾病发展到一定阶段都可出现疲劳。疲劳是现代社会快节奏的生活方式下的常见病理生理状态,属于亚健康范畴。疲劳会降低工作效率,使机体早衰,导致各种疾病,甚至出现过劳死等严重后果。黄芪茯苓原方是军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所(原名为:军事医学科学院卫生学环境医学研究所)于20世纪70年代研制的中药复方,根据研究所内部资料得知,黄芪茯苓原方在驻高原部队藏区军队里使用较多,是军队内部使用的药物,长期驻扎在藏区的军人服用黄芪茯苓原方后高原病的症状减轻或消失,其防治高原病的效果较好,由黄芪、党参、丹参、熟地、白芍、白术、沙参、当归、茯苓、首乌藤、陈皮、金果榄等12味中药组成。新黄芪茯苓复方是在黄芪茯苓原方的基础上删减而得。本文通过小鼠常压密闭缺氧实验和小鼠负重游泳实验,验证新黄芪茯苓复方的抗缺氧和抗疲劳作用,并以蛋白质组学技术为主要研究手段,从分子水平探讨新黄芪茯苓复方的抗缺氧作用机制,为其后续抗高原缺氧的开发利用提供良好的实验依据。目的:1.根据方剂配伍中药物的君臣佐使的基本原则,选取黄芪茯苓原方中的药物组成新的小方组,以达到用较少的药物组成达到相同或更好的防治效果;2.对新黄芪茯苓复方进行药效学实验,明确新黄芪茯苓复方的耐缺氧和抗疲劳作用,为进一步研究新黄芪茯苓复方的应用和开发提供理论依据;3.采用TMT定量蛋白质组学技术对小鼠心脏组织蛋白表达进行研究,并对实验结果进行生物信息学分析,寻找新黄芪茯苓复方抗缺氧作用的相关蛋白,初步探索新黄芪茯苓复方抗缺氧的分子作用机制。方法:1.药物筛选利用中医传承辅助平台软件,分析《中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂》中含黄芪的中药复方的组方规律,从原方12味中药内筛选出合适的药物组成新的简方——新黄芪茯苓复方。2.小鼠常压缺氧实验通过建立小鼠常压缺氧模型,以0.5%的羧甲基纤维素钠为空白对照,黄芪茯苓原方为阳性对照,观察不同剂量的新黄芪茯苓复方对小鼠体重和常压缺氧存活时间的影响。检测小鼠血清中的T-AOC、CAT、T-SOD、GSH-PX活力和MDA含量,心肌和脑组织中Na~+K~+-ATP酶、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶,并采用BCA蛋白定量法测定各组织的蛋白浓度。3.小鼠负重游泳实验通过小鼠负重游泳实验,以0.5%的羧甲基纤维素钠为空白对照,黄芪茯苓原方为阳性对照,观察不同剂量的新黄芪茯苓复方对小鼠负重游泳时间的影响。检测小鼠肝糖原、肌糖原和小鼠血清中的LA含量、LDH活力、BUN含量。4.TMT相对定量蛋白质组学生物信息学分析小鼠心脏差异表达蛋白质研究:以常压缺氧实验空白对照组和新黄芪茯苓复方高剂量组小鼠心脏组织为研究对象,对其进行蛋白质提取、肽段酶解、TMT标记、色谱分级,通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据采集对蛋白质进行鉴定和定量分析,筛选差异表达蛋白质,并对差异表达蛋白质进行聚类分析、功能注释和通路分析等。结果:1.药物筛选从黄芪茯苓原方12味中药内选取黄芪、茯苓、党参、当归、首乌藤、丹参6味中药组合成新的复方——新黄芪茯苓复方。2.小鼠常压缺氧实验新黄芪茯苓复方对小鼠体重的影响:实验中期和实验结束时黄芪茯苓原方和新黄芪茯苓复方各剂量组小鼠平均体重与空白对照组比较无统计学意义(P0.05),表明新黄芪茯苓对小鼠体重无不良影响。新黄芪茯苓复方对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响:与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方低、中、高剂量组小鼠缺氧存活时间明显延长(P0.05),新黄芪茯苓复方高剂量组与黄芪茯苓原方组之间无显著性差异,表明新黄芪茯苓复方可延长小鼠常压密闭缺氧存活时间,具有抗缺氧作用。新黄芪茯苓复方对小鼠血清中氧化抗氧化指标的影响:与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方高剂量组小鼠血清中T-AOC提高(P0.05),黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方各剂量组小鼠血清中CAT活力增强(P0.05),黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方中、高剂量组小鼠血清中SOD活力提高(P0.05),新黄芪茯苓复方各剂量组的小鼠血清中GSH活力增强(P0.05),黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方中、高剂量组小鼠血清中MDA含量降低(P0.05)。新黄芪茯苓复方对小鼠心肌组织和脑组织能量代谢的影响:(1)对心肌组织的影响:与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组和新黄芪茯苓复方高剂量组的Na~+K~+-ATP酶活力提高(P0.05),黄芪茯苓原方组和新黄芪茯苓复方高剂量组的Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活力提高(P0.05);(2)对脑组织的影响:与空白对照组比较,新黄芪茯苓复方高剂量组的Na~+K~+-ATP酶活力提高(P0.05),黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方低、中、高剂量组的Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活力提高(P0.05)。3.小鼠负重游泳实验新黄芪茯苓复方对小鼠负重游泳时间的影响:与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方低、中、高剂量组小鼠的负重游泳时间均显著提高(P0.01)。新黄芪茯苓复方对小鼠肝糖原和肌糖原的影响:与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方中、高剂量组小鼠的肝糖原储存量显著增高(P0.01),新黄芪茯苓复方低、中、高剂量组小鼠肌糖原的储存量均明显提高(P0.05)。新黄芪茯苓复方对小鼠血清中各指标的的影响:(1)与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组、新黄芪茯苓复方中剂量组小鼠血清中LA含量明显降低(P0.05),新黄芪茯苓复方高剂量组小鼠血清中LA含量显著降低(P0.01),且与黄芪茯苓原方组比较仍明显降低(P0.05),说明新黄芪茯苓复方可降低小鼠血清中的LA含量。(2)与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组和新黄芪茯苓复方低剂量组小鼠血清中的LDH活力明显升高(P0.05),新黄芪茯苓复方中、高剂量组小鼠血清中的LDH活力显著升高(P0.01),且与黄芪茯苓原方组相比,新黄芪茯苓复方高剂量组仍明显升高(P0.05),提示新黄芪茯苓复方可升高小鼠血清中的LDH的活力。(3)与空白对照组比较,黄芪茯苓原方组小鼠血清中的BUN含量明显降低(P0.05),新黄芪茯苓复方低、中、高剂量组小鼠血清中BUN含量显著降低(P0.01),且与黄芪茯苓原方组相比,新黄芪茯苓复方低剂量组小鼠血清中的BUN含量仍显著降低(P0.01),提示新黄芪茯苓复方可降低小鼠血清中的BUN含量。4.TMT相对定量蛋白质组学生物信息学分析本实验鉴定的二级质谱谱图总数为339,987张,其中肽段匹配的谱图数为77,963张,鉴定到的肽段总数是27,558个,唯一肽段总数是24,749个,鉴定到小鼠心脏中的蛋白质为3790个;其中,上调的差异表达蛋白质有10个,下调的差异表达蛋白质27个。差异表达蛋白质GO功能富集分析得GO功能注释共330条,包括亚铁血红素的eIF2α磷酸化的调节、翻译起始的eIF2α磷酸化的调节等268条重要生物过程,氧转运体活性、氧结合等52条分子功能,和血红蛋白复合物、胞浆部分等10条细胞组成。这些差异表达蛋白质的功能主要是结合、蛋白结合、阳离子结合、金属离子结合、离子结合,这些差异表达蛋白质主要参与了单细胞过程、细胞过程、生物调节、生物过程调节、刺激反应等重要生物学过程。差异表达蛋白质KEGG通路富集分析得知,上调差异表达蛋白质主要参与非洲锥虫病通路、疟疾通路、自身免疫性甲状腺疾病通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用通路、其他类型的O-聚糖的生物合成通路、人乳头瘤病毒感染通路、神经营养因子的信号转导通路等7条通路;下调差异表达蛋白主要参与非洲锥虫病通路、疟疾通路、自身免疫性甲状腺疾病通路、IL-17信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用通路、移植物抗宿主病、人乳头瘤病毒感染通路、神经营养因子的信号转导通路等8条通路。构建蛋白质与蛋白质相互作用网络,分析可知,共有4个上调与16个下调差异表达蛋白质存在直接或间接相互作用关系,其中,Gapdh、Hbb-b2、Arhgef6、H2-K1、Ighm、Cav3、Arhgdib、S100a8、S100a9等基因在网络中较活跃,对应的3-磷酸甘油醛脱氢酶、β珠蛋白、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子6、MHC H-2K抗原、免疫球蛋白链C区、微囊蛋白-3、Rho GDP解离抑制剂2、s100-a8蛋白、s100-a9蛋白在网络中与其他蛋白的相互作用较密切,提示在蛋白质相互作用网络中具有重要的作用。结论:1.新黄芪茯苓复方可延长小鼠常压密闭缺氧存活时间,具有抗缺氧作用;能清除过量的氧自由基,减少自由基对机体的损伤,具有抗脂质过氧化的作用,能够减轻细胞能量代谢,对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有保护作用,对缺氧诱发的氧化损伤具有良好的改善作用;能改善常压缺氧小鼠心肌和脑组织能量代谢,对抗缺氧造成的心肌和脑组织损伤。2.新黄芪茯苓复方可延长小鼠负重游泳时间,具有抗疲劳作用;能通过提高小鼠的肝糖原、肌糖原的储存量,降低小鼠血清中的LA含量和BUN含量,升高小鼠血清中的LDH的活力,减轻肌肉损伤,增强小鼠的抗疲劳能力。3.新黄芪茯苓复方抗缺氧作用可能与β珠蛋白、s100-a8蛋白、s100-a9蛋白等下调差异表达蛋白关系最为密切,与IL-17信号转导通路等通路有关,其确切机制还需进一步验证。
【学位单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

研究思路