东方铃蟾活性多肽的分离鉴定及功能研究

发布时间：2020-10-16 06:20

　　 目的:对东方铃蟾皮肤分泌物中的活性多肽进行分子克隆和分离鉴定,并进一步研究其生物学功能,为此类抗菌和抗肿瘤药物的开发提供理论依据和实验基础。方法:1.通过柱式法提取东方铃蟾皮肤总RNA,并使用SMARTer?RACE试剂盒进行逆转录构建c DNA文库。设计引物,并通过RT-PCR技术对c DNA文库进行扩增。将PCR产物通过p GEM?-T Easy载体系统进行克隆,对不同的克隆子进行基因测序。2.利用Chromas和Vector-NTI软件对测序基因进行编辑处理。将得到的核苷酸和氨基酸序列信息通过BLASTn和BLASTp检索,与EMBL-EBI、NCBI和Swiss Prot数据库中的数据进行同源性对比分析,推导出东方铃蟾成熟肽前体序列。通过Align X软件,与同源多肽前体序列进行结构比对。3.通过反相高效液相色谱法,对东方铃蟾皮肤分泌物中的多肽组分逐级分离,通过质谱法测定多肽的分子量和一级结构。4.采用固相合成法合成鉴定出的东方铃蟾皮肤分泌物中的活性多肽,通过I-TASSER网络服务器预测多肽的二级结构,使用Heliquest网络服务器预测多肽的螺旋轮状图和理化性质,如疏水性、疏水力矩、净电荷(Z)等。通过圆二色光谱法测定多肽的二级结构。5.通过MIC和MBC实验评价多肽的抑菌活性,通过溶血活性测定实验评价多肽的生物安全性和毒性。6.采用MTT比色法检测两种多肽对人肝癌Hep G2、SK-HEP-1和Huh7细胞,人前列腺癌PC3细胞、人肺癌A549细胞和人黑素瘤A375细胞的增值抑制活性。结果:1.以东方铃蟾皮肤总RNA为模版,成功构建了东方铃蟾皮肤c DNA文库。根据Genebank已报导编码铃蟾类多肽c DNA5’端非翻译区的保守序列设计引物,利用PCR技术扩增得到一个新型bombinin多肽前体c DNA序列。2.Bombinin多肽前体c DNA序列共编码两种bombinin多肽,一种为首次发现的bombinin H型多肽,命名为Bombinin H-BO,另一种为已报导的bombinin类似肽-BLP-7。3.通过高效液相法,从东方铃蟾皮肤分泌物中分离出BLP-7和Bombinin H-BO两种多肽,利用质谱技术解析两种多肽的一级结构分别为:BLP-7(GIGGALLSAGKSALKGLAKGLAEHFAN-NH2),Bombinin H-BO(IIGPVLGLIGKALGGLL-NH2)。4.通过固相合成法成功合成两种bombinin多肽,纯度95%。多肽的二级结构和理化性质预测结果表明,BLP-7中α-结构域的比例为74.07%,带有2个正电荷;Bombinin H-BO中α-结构域的比例为64.71%,带1个正电荷。两种多肽都具有两亲性。5.BLP-7具有显著抑菌活性,对大肠杆菌的MIC为6.3μM,金黄色葡萄球菌的MIC为6.3μM,白色念珠菌MIC为12.5μM。Bombinin H-BO在最大受试浓度159.7μM时,对三种微生物的抑制率约为50%。BLP-7在浓度为50.2μM时,无溶血活性。Bombinin H-BO在浓度为80.0μM时,引起38%的红细胞溶血,浓度为159.7μM时,引起85%红细胞发生溶血。6.BLP-7和Bombinin H-BO可抑制三种人肝癌细胞和其他几种人体癌细胞的生长增殖,具有剂量依赖性。其中,BLP-7和Bombinin H-BO对A549细胞的抑制作用最为显著,作用48 h后IC50值分别为0.244μM和0.597μM。结论:1.利用分子克隆技术,结合高效液相色谱及生物质谱的研究手段,从东方铃蟾皮肤分泌物中分离鉴定出两种bombinin多肽-BLP-7和Bombinin H-BO,其中Bombinin H-BO的结构为首次报道,是一种新型的bombinin H型多肽。2.BLP-7和Bombinin H-BO在体外具有抗菌、抗肿瘤等生物学活性,具有潜在的应用价值,其具体的抗菌和抗肿瘤作用机制有待进一步研究。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284.2;R285
【部分图文】：

图 1.1 东方铃蟾活性多肽的 PCR 扩增结果A 的 PCR 扩增结果多肽的前体序列 S1 和 S2 与 pGEM -T Easy 载体态细胞中复制扩增后，通过加热裂解法提取质粒NA 进行 PCR 扩增，得到含有重组载体基因的 DNA4 来自 S1 的转化子质粒，A5-A8 来自 S2 的转化bpbp1000600400200M S1 S2

东方铃蟾活性多肽的PCR扩增结果

天津医科大学硕士学位论文 一、东方铃蟾活性多肽的分离和鉴定1.2.1.3 Bombinin 多肽的基因测序结果将质粒 DNA 扩增后得到的不同克隆子，随机挑选 A1、A2、A4、A5、A6、A7、A8 进行基因测序。A1、A4 和 A5 测序结果相同，均为编码 BLP-7 和Bominin-BO 前体的基因序列，如图 1.3。其他 PCR 产物测序得到不同的 bombinin多肽前体序列。
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本文编号：2842889