贵州产青钱柳对Ⅱ型糖尿病大鼠的降糖作用机制及其化学成分研究

发布时间：2020-10-19 08:22

　　 目的:青钱柳为胡桃科青钱柳属青钱柳种植物(拉丁名:Cyclocarya palaurus.(Batal.)Ijinskaja),已有研究报道青钱柳叶具有调节血糖、降血脂、抗氧化等多种保健功效。《中国中药资源志要》中记载,青钱柳叶具清热消渴解毒之效,对糖尿病有一定的疗效,但目前青钱柳的降糖物质基础还缺乏深入系统的研究,不利于青钱柳的进一步开发与利用。鉴于此,本课题从整体动物、体外模型、化学成分三个方面,开展青钱柳对Ⅱ型糖尿病大鼠的体内外保护作用机制及其化学成分研究,从而阐明青钱柳活性部位改善Ⅱ型糖尿病的作用机制,明确青钱柳的降糖活性成分,为以后青钱柳的降糖物质基础研究和临床应用提供依据。方法:1、青钱柳对Ⅱ型糖尿病大鼠降糖作用的机制研究采用高脂饲料喂养,结合腹腔注射低剂量STZ的方法诱发Ⅱ型糖尿病大鼠模型的发生。分别给予二甲双胍马来酸罗格列酮阳性药(200mg/kg),低剂量(1.5g/kg)、中剂量(3g/kg)、高剂量(6g/kg)贵州产青钱柳水提液进行干预治疗,持续定时给药12w。在给药2、4、8、12w后,分别取尾静脉血测定各组大鼠的空腹血糖值。给药12w后,检测各组大鼠末次空腹血糖值及葡萄糖耐量,并检测大鼠血清中GSP、TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。包埋切片各组大鼠的胰腺组织和肝脏组织并进行HE染色等处理,镜检并分析组织病理形态。2、青钱柳化学成分的研究以原儿茶酸、异槲皮苷、槲皮素、山奈酚、齐墩果酸、熊果酸为青钱柳的质量评价的指标性成分。采用Thermo Syncronis C_(18)柱(5μm,250mm×4.6mm),流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水(B),进行梯度洗脱;流速1mL/min,柱温30℃;检测波长分别为260nm、360 nm、210nm等色谱条件,建立HPLC波长切换法对不同青钱柳中上述成分进行分析,同时采用比色法对其总多糖进行定量测定,以判断贵州产青钱柳的质量。采用大孔吸附树脂柱色谱法分离青钱柳各极性洗脱部位,运用HPLC法明确各部位的分离情况,并用紫外分光光度法测定各洗脱部位的总黄酮和总皂苷含量。将进一步分离出的不同洗脱部位进行体外α-葡萄糖苷酶抑制作用研究,以筛选降糖活性部位。3、青钱柳降糖活性部位的质谱分析研究为了明确青钱柳降糖活性部位的化学成分,研究运用四极杆-静电场轨道阱串联质谱法(Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS),采用色谱柱Thermo Accucore C_(18)柱(2.6μm,100mm×2.1mm);流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)进行梯度洗脱;流速为0.3mL/min,柱温35℃;质谱离子源为ESI源,检测模式为正模式和负模式;扫描模式为Full MS/dd-MS2,扫描范围m/z 200~1600,MS/MS模式时碰撞能为NCE 20eV、40eV和60eV等条件,对青钱柳经体外筛选降糖作用较优的乙酸乙酯部位60%乙醇洗脱液的化学成分进行定性分析。通过对各个色谱峰的质谱数据进行解析,对比已知化合物的裂解规律,综合保留时间、MS数据及参考文献报道数据对各个色谱峰进行结构鉴定。同时运用气相色谱-质谱法(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS),条件采用5HP石英毛细管柱(30m×0.25mm,0.2μm),载气流量为0.9mL/min,气化室温度280℃,进行梯度升温;质谱离子源为EI,离子源温度250℃;电子能量70eV,扫描范围30~600m/z等条件,对在体外有一定降糖作用的青钱柳石油醚部位进行定性分析,通过NIST标准库对各个色谱峰的质谱数据进行比对解析。结果表明:1、贵州产青钱柳水提液有显著的降糖作用,能明显降低Ⅱ型糖尿病大鼠的空腹血糖,并增强其对葡萄糖的耐受能力,降低血液GSP和TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。HE染色切片显示青钱柳干预组胰岛细胞和肝细胞较正常,肝索结构得到修复,证明青钱柳能抑制胰岛细胞萎缩,改善胰岛的损伤,降低肝细胞内脂肪的含量,改善肝的损伤。故推断贵州产青钱柳的降糖作用机制主要可能有:修复受损的胰岛β细胞和肝组织,促进胰岛素分泌同时避免胰岛功能进一步受损;改善机体脂代谢紊乱,抑制因糖化血清蛋白产生所导致的蛋白非功能化的恶性循环。2、建立了青钱柳化合物的HPLC定性和定量方法,绝大数青钱柳样品中含有槲皮素和山奈酚,而多糖为青钱柳水提物中主要成分,三者可作青钱柳的指标性成分。贵州产青钱柳中槲皮素(0.1232mg/g)、山奈酚(0.0883mg/g)和总多糖(70.11mg/g)的含量较于其它实验样品高,属于质量较好。经紫外分光光度法对青钱柳的各分离部位进行分析,乙酸乙酯部位60%乙醇洗脱液的总黄酮和总皂苷含量很高分别为0.1118mg/mL和4.401mg/mL。进一步的体外α-葡萄糖苷酶抑制实验发现乙酸乙酯部位60%乙醇洗脱液的抑制效果最佳,IC_(50)为20.40mg/mL。3、经LC-MS/MS分析降糖活性成分聚集的乙酸乙酯部位60%乙醇洗脱液可能含有3个黄酮苷和19个三萜皂苷,如Rhamnazin、Kaempferitrin、cyclocarioside C、cyclocariosideⅡ、secodammara-25,26-dien-3-oic acid-24-O-D-xylopyranoside等化合物可能是青钱柳的主要降糖物质。经GC-MS分析发现有一定降糖活性的青钱柳石油醚部以丁香酚和植物醇为主,还含有β-石竹烯、乙酸丁香酚酯、亚麻酸甲酯、新植二烯、鲨烯、β-榄香烯、α-姜黄烯等。青钱柳挥发部位以β-紫罗酮和β-谷甾醇为主。丁香酚、植物醇、β-紫罗酮及β-谷甾醇亦可作为青钱柳的活性成分。初步明确贵州产青钱柳降糖作用的化学物质基础。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5;R284
【部分图文】：

D E F图 6 青钱柳水提液对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺组织的影响（HE，×200）A.正常对照组 B.模型组 C.阳性组 D.青钱柳低剂量组 E.青钱柳中剂量组 F.青钱柳高剂量组2.3.7 青钱柳对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏组织病理学的影响结果如图 7 所示，正常对照组大鼠肝脏结构完整，细胞核居于细胞中心，肝小叶结构正常，细胞呈放射性规则排列，其内无多余脂肪滴集群，模型组大鼠肝小叶界限模糊，其细胞索散乱分布，大部分干细胞尤其在小叶中央静脉局部细胞出现较多的脂肪变性，视野下的胞浆内出现数量和大小不一的脂滴空泡[77]。阳性药组大鼠的肝小叶结构部分变形，其细胞索散乱分布和脂肪性病变[78]。与模型组相比，青钱柳低、中、高剂量组能不同程度上改善大鼠肝脏病理病变，特别是青钱柳高剂量组可明显改善大鼠肝细胞损伤，肝细胞排列比较规则，无过多的脂肪聚集。说明青钱柳可降低细胞内脂肪含量，改善脂代谢紊乱，有一定的保肝作用。

D E F图 7 青钱柳水提液对Ⅱ型糖尿病大鼠肝形态的影响（HE，×200）A.正常对照组 B.模型组 C.阳性组 D.青钱柳低剂量组 E.青钱柳中剂量组 F.青钱柳高剂量组2.4 小结实验主要研究青钱柳水提液中有效成分对糖尿病合并高血脂模型大鼠血糖、血脂含量的影响，选取大鼠体重、糖耐量、糖化血清蛋白作为血糖检测指标[78]。贵州产青钱柳水提液能明显降低Ⅱ型糖尿病大鼠的空腹血糖，并增强其对葡萄糖的耐受能力，结合对大鼠胰岛的病理切片观察，青钱柳能抑制胰岛细胞萎缩，改善胰岛的损伤，推断青钱柳的主要降糖机制可能是其所含成分能修复受损的胰岛 β 细胞，避免胰岛 β 细胞进一步损伤，并促使胰岛分泌胰岛素以达到降糖效果。青钱柳各组 GSP 均比阳性组低，说明青钱柳具有抑制因糖和蛋白质的非酶促反应导致蛋白质非功能化，所产生的糖化血清蛋白又加速这一进程发生的恶性循环，从而缓解Ⅱ型糖尿病症状的作用。临床上认为，过高的 TC、TG 和 LDL-C 会

26图 8 芦丁标准液与青钱柳乙酸乙酯部位 95%乙醇洗脱液于200nm-600nm 波长扫描的吸收光谱图 青钱柳各洗脱部位总皂苷的含量测定试剂制备5%香草醛冰乙酸溶液：称取香草醛 0.5g，加入冰乙酸溶解并定容至 10。人参皂苷 Re 标准液：精密称取人参皂苷 Re 对照品 2.0mg，加甲醇定L，得浓度为 0.2mg/mL 的人参皂苷 Re 标准液。样品测定分别吸取乙酸乙酯部位 60%乙醇洗脱液 50μl、乙酸乙酯部位 95%乙醇洗l 和其它各洗脱部位 1.0mL 于蒸发皿中，60℃水浴挥干溶剂，冷却至室温 5%香草醛冰乙酸溶液 0.2mL 复溶残渣，再加高氯酸 0.8mL，混匀后移入
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本文编号：2846968