蛞蝓抗支气管哮喘作用和机制及其质量控制研究

发布时间：2020-10-19 13:52

　　 目的:通过蛞蝓抗大鼠支气管哮喘作用和对小鼠止咳化痰作用研究,探讨其抗支气管哮喘作用机制,筛选蛞蝓止咳化痰活性成分。建立以活性成分为指标的含量测定方法,为蛞蝓质量控制体系的建立及蛞蝓药材的综合利用提供实验依据。方法:1.将40只SD大鼠随机分为6组,每组8只,分别为正常组、模型组、地塞米松组、蛞蝓高剂量组、蛞蝓低剂量组。除正常组外,其余各组于实验第1、8天腹腔注射10%OVA溶液1mL,第8天追加臀部皮下注射10%OVA溶液0.2mL致敏塑造支气管哮喘大鼠模型,正常组注射等体积生理盐水。第15天开始,将大鼠放于超声雾化箱,超声雾化喷入2%OVA生理盐水10mL激发3周,每次雾化30min,每日一次,正常组用生理盐水代替2%OVA,记录哮喘潜伏期。激发前1h,给予药物灌胃干预,给药剂量分别为地塞米松组1mg·kg~(-1)、蛞蝓高剂量组92mg·kg~(-1)、蛞蝓低剂量组23mg·kg~(-1)、正常组给予同等体积生理盐水(给药体积0.01mL·g~(-1))。末次激发后,10%水合氯醛麻醉大鼠,按要求采集标本,采用ELISA法测定大鼠血清及BALF的LT、IL-4、IFN-γ含量;部分肺组织行病理切片,HE染色,观察肺组织结构及炎症浸润;采用免疫组化法测PTEN蛋白表达含量;采用RT-PCR法测肺组织中PTEN mRNA含量;2.取48只昆明小鼠,分为6组,每组8只,分别为正常对照组、咳必清组、蛞蝓提取物高、低剂量组、多糖高、低剂量组,灌胃给药,给药剂量分别为咳必清50mg·kg~(-1)、蛞蝓提取物高剂量300mg·kg~(-1)、蛞蝓提取物低剂量100mg·kg~(-1)、多糖高剂量组200mg·kg~(-1)、多糖低剂量组50mg·kg~(-1)、正常组给予等体积生理盐水。给药5天后以20%氨气引咳,记录3min内小鼠咳嗽潜伏期及咳嗽次数;取48只昆明小鼠,分组及给药剂量同上,盐酸氨溴索组给药剂量为100mg·kg~(-1),给药5天后腹腔注射5%酚红,检测小鼠气管段酚红排泌量,初步筛选蛞蝓止咳化痰活性成分;3.采用显微鉴别法、薄层色谱法对蛞蝓药材进行定性鉴别;参照2015年版《中国药典》四部通则下“水分检测法”、“灰分检测法”、“浸出物检测法”检测不同产地蛞蝓水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物等相关项目;采用苯酚-硫酸比色法,对不同产地蛞蝓药材多糖含量进行测定。结果:1.与模型组相比,地塞米松组、蛞蝓高剂量组均能延长大鼠哮喘潜伏期(P0.05);与正常组比较,模型组大鼠血清及BALF中LT、IL-4含量增加,IFN-γ含量减少(P0.05);与模型组比较,地塞米松组、蛞蝓提取物高组大鼠血清中LT、IL-4含量明显下降,IFN-γ含量上升(P0.05);地塞米松组、蛞蝓提取物高、低剂量组大鼠BALF中LT、IL-4含量明显下降,IFN-γ含量上升(P0.05);HE染色可见,正常组大鼠肺组织、支气管上皮结构完整,管腔内无炎症物质渗出,肺泡大小正常,无粘连,无炎性分泌物;模型组大鼠支气管上皮可见明显脱落坏死,支气管壁增厚,支气管周围炎性浸润严重,管腔变小,腔内炎症物质聚集,肺泡壁粘连增厚,肺泡数减少,肺泡腔内可见炎性分泌物;地塞米松组、蛞蝓高和低剂量组支气管壁轻度增厚,腔内炎性物质减少,支气管上皮无脱落坏死,肺泡壁粘连减轻;大鼠肺组织支气管PTEN蛋白表达免疫组织化学染色结果显示,正常组大鼠肺组织支气管周围PTEN大量表达,地塞米松组,蛞蝓提取物高剂量组PTEN蛋白表达减少,蛞蝓低剂量组、模型组肺组织PTEN蛋白表达呈弱阳性;PCR结果显示,与模型组相比,地塞米松组、蛞蝓高剂量组大鼠肺组织PTEN mRNA含量增多(P0.05)。2.与正常对照组相比,咳必清组、蛞蝓提取物组、多糖组小鼠咳嗽次数明显减少、咳嗽潜伏期延长(P0.05);与正常对照组相比,盐酸氨溴索组、多糖高剂量组小鼠酚红排泌量明显增加(P0.05);3.采用显微鉴别、薄层鉴别法对不同产地的蛞蝓进行定性鉴别,结果显示不同产地的蛞蝓性状特征,斑点位置、颜色均大致相同;不同产地蛞蝓各项检查项目符合规定;建立了采用UV法测定蛞蝓多糖含量测定方法,方法学考察结果显示该方法精密度、稳定性、重复性和加样回收试验均符合《中国药典》相关标准。结论:1.通过建立支气管哮喘大鼠模型,考察蛞蝓提取物对支气管哮喘的治疗作用,结果显示蛞蝓提取物抗支气管哮喘效果显著,其作用机制可能与影响Th1/Th2细胞因子平衡,上调PTEN表达有关;2.蛞蝓具有明显止咳化痰作用,初步确定蛞蝓的止咳化痰主要活性成分为多糖;3.建立了蛞蝓鉴别方法;制定了蛞蝓水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的参考限量;建立了蛞蝓多糖含量测定方法。
【学位单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

取物对支气管大鼠哮喘潜伏期的影响组相比，地塞米松组、蛞蝓高剂量组均能延.05）。见表 1-2。 1-2 蛞蝓提取物对支气管哮喘大鼠哮喘潜伏期影响( x s剂量（mg·mL-1） 哮喘40.5 1 68.1组 23 49.2组 92 56.5组相比，▲P<0.05

（P<0.05）；地塞米松组、蛞蝓高、低剂量组 BALF 中 LT、IL-4 含量明显下降，IFN-γ 含量上升（P<0.05）。见表 1-3、1-4。表 1-3 蛞蝓提取物对支气管哮喘大鼠血清 LT、IL-4、IFN-γ 的影响( x s，n=8)分组 LT（ng·L-1） IL-4（ng·L-1） IFN-γ(ng·L-1) IFN-γ/IL-4正常组 31.39±6.28▲12.66±0.61▲165.43±20.21▲12.62±2.26▲模型组 39.31±5.43 14.64±0.55 130.66±4.66 9.93±0.86地塞米松组 33.56±1.09▲13.84±0.39▲173.95±19.07▲13.22±1.71▲蛞蝓低剂量组 32.24±2.87▲14.06±0.56 144.30±116.20 10.96±1.41蛞蝓高剂量组 31.69±1.76▲13.23±1.05▲173.27±38.42▲13.21±2.37▲注：与模型组相比，▲P<0.05

表 1-4 蛞蝓提取物对支气管哮喘大鼠 BALF LT、IL-4、IFN-γ 的影响( x s，n=8)分组 LT（ng·L-1） IL-4（ng·L-1） IFN-γ(ng·L-1) IFN-γ/IL-4正常组 19.52±1.83▲10.58±0.67▲14.41±1.78▲1.35±0.09▲模型组 23.21±1.61 14.39±0.77 11.24±1.12 0.78±0.04地塞米松组 19.28±1.07▲10.51±0.81▲14.42±1.87▲1.37±0.08▲蛞蝓低剂量组 20.81±1.54▲9.32±1.07▲13.33±0.74▲1.44±0.09▲蛞蝓高剂量组 20.26±1.91▲10.43±1.02▲14.35±2.02▲2.08±0.77▲注：与模型组相比，▲P<0.05
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本文编号：2847294