异藤黄酚对HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用研究

发布时间：2020-10-24 05:32

　　 自由基是人体正常生理代谢过程中产生的原子或基团,过量的自由基不仅会引发食品的链式氧化,加速食品的腐败变质,而且还会导致氧化应激,引起肝脏疾病、糖尿病、神经性退行疾病和心血管疾病等。目前常用的人工合成抗氧化剂,如:丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)和叔丁基对苯二酚(TBHQ),均具有毒副和致癌作用,因此,寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂已经成为了一种必然的趋势。异藤黄酚作为一种异戊烯基取代的苯甲酮类天然化合物,具有抗炎、抗菌和抗疟疾等多种生物活性。目前研究表明异藤黄酚在体外具有一定的抗氧化活性。因此,本研究采用体外化学测定法和细胞模型法分别检测了异藤黄酚的抗氧化活性、细胞毒性、遗传毒性以及异藤黄酚对H202诱导HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用,并初步探究了保护机制。同时还利用化学实验方法和高效液相色谱分析法分别检测了海南藤黄科三个属7种代表性植物树皮的抗氧化活性及其中异藤黄酚的含量,准确地了解了其资源,为异藤黄酚的开发和利用提供了理论依据。其中详细的结果如下:(1)在DPPH和ABTS实验中,异藤黄酚对两者的清除能力均强于VC和BHT,并与浓度呈现量效关系。其中,异藤黄酚的IC50分别是36.27 ±3.35和16.63 ±3.98 μM。在还原能力测定实验中,随着异藤黄酚浓度的升高,反应体系的吸光值不断增大,但始终弱于VC和BHT。异藤黄酚抗脂质过氧化能力与BHT相当。而且,随着异藤黄酚浓度的增大,FRAP值也越大。(2)在细胞毒性实验中,异藤黄酚的浓度在1～10 μM范围内时,细胞的存活率均在95%以上。但当浓度为13和15 μM时,细胞的存活率分别下降到88.87%和82.28%。在遗传毒性实验中,异藤黄酚在50和100 μM时细胞没有显示出明显的拖尾现象,在500μ 时显示出轻微的拖尾。而BHT在50μ 时就已经出现明显的拖尾,在500 μM时,拖尾现象更加明显。(3)通过CCK-8法确定了 H2O2诱导HepG2细胞氧化应激损伤的最佳建模条件为H202浓度为500μ 时,诱导培养HepG2细胞3 h。此时细胞的存活率是对照组的56.13%,达到了显著水平(p 0.01)。经终浓度为0.5,1和1.5 μM的异藤黄酚预保护的细胞与仅用H202处理的细胞相比,其细胞存活率分别提高了 12.67%、25.01%和28.93%,并且差异显著(p 0.01)。此外,相同处理浓度(1.5 μM)时,异藤黄酚处理组(76.68%)的细胞存活率明显高于BHT处理组(67.99%)但低于VE处理组(81.57%)。(4)在探究异藤黄酚保护细胞氧化应激损伤机制的过程中,实验结果显示:HepG2细胞经过异藤黄酚(0.5～1.5 μM)预先处理后,LDH的漏出率和ROS水平比H2O2处理组分别降低了 10.67%～36.61%和16.83%～40.91%,均达到了显著差异水平,且呈现出剂量依赖型关系。此外,MDA含量分别比H202处理组降低了 10.41 ～42.27%。同时,HepG2细胞经H2O2处理后,H2O2处理组中GSH的含量(5.71 nmol/mg protein)比正常对照组(16.41 nmol/mgprotein)降低了 65.20%。而经异藤黄酚预保护,细胞内的GSH含量比H202处理组显著地得到了提高(p0.05)。而且当浓度为1.5 μM时,异藤黄酚(21.96 nmol/mg protein)保护组细胞内的GSH含量分别比正常对照组提高了 33.82%。经过0.5～1.5μ 异藤黄酚预先保护细胞,体内的SOD活性与H202处理组相比,也分别提高了 25.18～51.11%。(5)海南藤黄科三个属代表性植物的树皮提取液随着浓度的增加,其抗氧化活性体现出递增的趋势,其中红厚壳属植物红厚壳对DPPH和ABTS自由基的清除效果最好,而薄叶红厚壳和多花山竹子的活性最弱。在还原能力实验中,藤黄属植物(岭南山竹子,多花山竹子和山竹子)的还原能力高于红厚壳属(红厚壳和薄叶红厚壳)和黄牛木属(黄牛木和越南黄牛木)的植物。树皮提取液清除超氧自由基(O2-)的能力与浓度成正相关的关系。在清除率为50%的时候,山竹子、越南黄牛木和红厚壳的抗氧化性明显高于其余四种植物。(6)异藤黄酚在山竹子、岭南山竹子、单花山竹子、黄牛木、薄叶红厚壳中的含量分别为0.285%、0.199%、0.857%、0.161%和0.006%,而越南黄牛木和红厚壳中没有检测出异藤黄酚。综上所述,本研究揭示了异藤黄酚具有较强的抗氧化活性,较低的细胞毒性和遗传毒性,能够对H202诱导的HepG2细胞氧化应激损伤起到保护作用。此作用的发挥主要依赖于异藤黄酚对细胞内ROS含量、LDH漏出率和MDA水平的降低。同时,异藤黄酚还可以增加细胞内GSH含量和SOD活性,从而减少体内自由基的含量。此外,海南藤黄科的具有一定的抗氧化活性,而且在三个属7种代表性植物树皮中,异藤黄酚在藤黄属植物(山竹子、岭南山竹子、单花山竹子)中含量较高,尤其单花山竹子含量最为丰富。因此,异藤黄酚具有较好的抗氧化效果,毒性较低,而且来源丰富,有望成为一种新型抗氧化剂,用于氧化应激相关疾病的治疗。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：

ＤＰＰＨ？是一种为数不多的稳定型有机氮自由基，它能溶于乙醇溶液显示出紫红??色，在５１７?ｎｍ处有最大吸光值，通过与抗氧化剂结合，导致颜色变浅，吸光值减小，??抑制率降低，从而评估抗氧化剂清除自由基的活性（曾维才等，２０１３）。从图２可知，??由图可知，随着异藤黄酚浓度的增加，对ＤＰＰＨ？的清除率也在逐步增大，但增幅逐??渐减少，说明异藤黄酚的浓度与清除ＤＰＰＨ？的能力不仅存在正量效关系，而且具有??饱和型特征。主要是由于ＤＰＰＨ？浓度一定时，异藤黄酚浓度己经超出了反应体系中??清除ＤＰＰＨ？所需要的浓度。ＩＣ５〇表示当清除率为５０％时所需抗氧化物质的浓度，因此，??ＩＣ５０值越小，其清除能力就越强，其抗氧化活性就越强。通过ＩＣ５〇计算软件，得出异??藤黄酚、ＶＣ?和?ＢＨＴ?的?ＩＣ５０分别为?３６．２７?±３．３５、６６．０１?±１．９０?和?１１６．２６?±２．５５?ｎＭ?（如??表３）。异藤黄酚的抗氧化活性强于对照ＶＣ和ＢＨＴ，分别是它们的２倍和３倍，达??到了极显著水平（ｐ＜?０．０１）。因此，在清除ＤＰＰＨ？实验中，异藤黄酚表现出很强的??抗氧化活性。??１００－１??９〇－?Ｉｓｏ??？?７０－?＋?Ｖｃ??Ｓ?Ｘ?ＢＨＴ??ｓｏ－?／?

阳离子自由基ＡＢＴＳ％?ＡＢＴＳ？在抗氧化物质的作用下，能够被部分或者完全清除，??溶液颜色变浅，然后通过检测吸光值变化得出抑制率，从而确定该物质的抗氧化能力。??吸光值越大，抑制率越大，则抗氧化性越好（ＩｌｈａｍｉＧ，２０１２）。由图３可知，随着??异藤黄酚浓度的增加，异藤黄酚对ＡＢＴＳ？的清除率也在不断地增大，而且关系接近??线性，这说明异藤黄酚浓度与清除ＡＢＴＳ？的能力存在剂量依赖型关系。此外，在测??试范围内异藤黄酚的清除率始终大于ＶＣ和ＢＨＴ，且由表３可知，异藤黄酚、ＶＣ和??ＢＨＴ?的?ＩＣ５０?分别为?１６．６３?±?３．９８、５９．４３?±?３．４５?和?１８３．４?±?３．８９?ｐＭ，ＩＣ５０分别是它们的??１／３和１／１１。因此，在ＡＢＴＳ？清除实验中，异藤黄酚同样表现出较强的抗氧化活性，??且强于对照ＶＣ和ＢＨＴ，与清除ＤＰＰＨ？的效果基本相同。??８０￣｜??Ｉｓｏ??７〇－?－?Ｖｃ??１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０?８０??样品浓度ＣｐｍｏＶＬ）??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ?（ｐｔｍｏｌ／Ｌ）??图３异藤黄酚对ＡＢＴＳ？的清除能力??Ｆｉｇ．?３?Ｔｈｅ?ＡＢＴＳ？?ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｉｓｏｇａｒｃｉｎｏｌ??注：Ｉｓｏ：异藤黄酚；Ｖｃ：维生素Ｃ；?ＢＨＴ：?２，６－二叔丁基冰甲基苯酚??３．１．３异藤黄酚的还原能力??在实验中

注：Ｉｓｏ：异藤黄酿；Ｖｃ：维生素Ｃ；?ＢＨＴ：?２，６－二叔丁基－４－甲基苯酚??３．１．４异藤黄酚抗脂质过氧化的能力??从图５中得知，异藤黄酚和ＢＨＴ的抗脂质过氧化能力与浓度呈量效关系。随着??浓度的增加，其抗脂质过氧化能力也在不断增强。但异藤黄酚和ＢＨＴ的抗脂质过氧??化能力相当。在测试浓度范围内，当浓度大于１８０?ｐＭ时，异藤黄酚抗脂质过氧化能??力略高于ＢＨＴ。经计算，异藤黄酚和ＢＨＴ的ＩＣ５Ｇ分别为１７５．８３和１７８．０９?（ｉＭ，两者??之间不存在显著差异（ｐ＜?〇．〇５＿）。??＿?８０－??己?７０－?－？？－?Ｉｓｏ??Ｓ．Ｉ?６０－?＊?ＢＨＴ??Ｉ！：：：??ｇ．ｆ３〇－??Ｓｆ?２〇－ｉｒ＾＊＾??ｇ?１０－＾＾??＾?〇Ｊ?．?．?．?．?．?．??２０?６０?１００?１４０?１８０?２２０?２６０??ｉｔ？?浓度（ｉ－ｉｎｉｏｌ／Ｌ）??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ?（ｐ．ｍｏｌ／Ｌ）??图５异藤黄酚抗脂质过氧化能力??Ｆｉｇ．?５?Ｔｈｅ?ａｎｔｉ－ｌｉｐｉｄ?ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｉｓｏｇａｒｃｉｎｏｌ??注：Ｉｓｏ：异藤黄酿；ＢＨＴ：?２，６－二叔丁基冬甲基苯酚??３．１．５总抗氧化能力的测定??ＦＲＡＰ法主要是基于还原反应来测定某种物质的总抗氧化能力。酸性条件下抗氧??化物可以还原Ｆｅ－ＴＰＴＺ产生蓝紫色的Ｆｅ－ＴＰＴＺ，随后在５９３?ｎｍ测定吸光度，即可作??为样品中的总抗氧化能力的指标。其中，总抗氧化能力用ＦｅＳ０４标准溶液的浓度来表??示。从图６中可以得知
【参考文献】

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本文编号：2854082