马兜铃酸降解菌和肾毒性分子标志物的筛选及应用

发布时间：2020-10-25 18:20

　　 目的:(1)获得具有降解马兜铃酸I(aristolochic acid I,AAI)的微生物资源,选择最优菌株进一步分析鉴定;(2)探索AAI致肾损伤的分子机制,筛选出有潜力的AAI肾毒性分子标志物;(3)将获得的降解菌株应用于AAI含量较高的青木香进行发酵炮制,再结合本研究中筛选得到的分子标志物对其肾毒性进行评价。方法:本课题一方面运用微生物纯培养技术从含马兜铃酸植物的根际土壤中分离纯化出了多株能够降解AAⅠ的细菌菌株,比较了这些菌株的降解能力后,选取了降解能力最高的菌株进行分子鉴定,并测定其全基因组序列,进行比较基因组分析。另一方面,通过采集NCBI、TCGA中现有的AAⅠ动物实验测序数据及原发性肾癌的测序数据,统计分析AAⅠ引起的肾脏基因表达的改变,然后对相关差异表达基因进行富集分析及信号通路分析以阐明AAⅠ致肾损伤的分子机制;再结合原发性肾癌的分析结果进行比对,从而筛选出有潜力的AAⅠ肾毒性分子标志物并进行验证。最后,我们用降解能力最高的菌株对含AAⅠ的药材进行发酵,并进行动物实验,再结合本研究中筛选得到的分子标志物对其毒性进行评价。结果:(1)从马兜铃根际土壤中获得33株纯培养菌株,经验证其中11株对AAⅠ有着不同降解能力,最高可在非优化条件下48h降解85.36%;从樟树根际获得6株纯培养菌株,后期验证均不能降解AAⅠ。(2)用PCR技术对降解能力最强的菌株16S rRNA基因序列进行了扩增,并测序;基于16S rRNA基因序列进行分子鉴定,得出该菌株为Sphingobium属的一个潜在新种,暂命名为Sphingobium sp.AA3。(3)对Sphingobium sp.AA3的500×基因组二代测序质量较好,最终组装形成了78个contigs,基因组总大小为5,538,228 bps。该菌株基因组与其近缘菌株基因组之间差距较大,支持该菌株为Sphingobium属的新种。Sphingobium sp.AA3基因组中包含5,663个基因,其中5,581个基因是编码基因,其中73%得到了功能注释。被注释的基因中有近1/3为代谢相关蛋白,其中有多个基因可能与芳香族化合物的降解有关。(4)AAI引起代谢途径基因表达改变,并表现出与原发性肾癌相似的Warburg效应;AAI和原发性肾癌均上调PI3K途径,但是通过上调不同的PI3K通路蛋白实现;AAI同时表现出上调细胞凋亡和坏死途径的复杂属性;多个基因在马兜铃酸肾病和原发性肾癌中的表达模式一致,部分基因与肾癌病人的生存与预后密切相关。(5)动物实验结果证明,AAI导致了Acad11、Enpep的下调以及PANX2、WNT7B的上调,这与原发性肾癌中基因的异常表达模式是一致的;同时AAI也引发了Prima1的下调以及Cdkn1a的上调,而这是与原发性肾癌有区别的,因而有可能是AAI肾毒性的分子标志物。(6)经HPLC检测,Sphingobium sp.AA3能有效降解青木香水煎剂中的马兜铃酸I,降解率超过90%。(7)动物实验结果表明,青木香水煎剂和马兜铃酸标准溶液灌胃小鼠可造成小鼠的肾脏外形的明显改变,以及Prima1、Wnt7b、Cdkn1a相应的表达变化;而Sphingobium sp.AA3青木香水煎剂的发酵液结果则几乎与生理盐水对照组相似,提示利用Sphingobium sp.AA3发酵具有控制大剂量青木香水煎剂的急性肾毒性作用的可能性。结论:马兜铃的根际土壤中存在着利用马兜铃酸Ⅰ的菌株,本课题所获得的菌株中以AA3的降解能力最强,经鉴定为Sphingobium属,并用二代测序技术测定了全基因组序列,分析了其遗传信息背景,以便于后续进一步研究分析。对NCBI、TCGA中现有的AAⅠ动物实验测序数据结合原发性肾癌的测序数据进行的系列分析和定量PCR验证,筛选了Prima1、Acad11、Enpep、Epha2、Psmb8、Bcl3、Axl、Hgfac、Cd276、Mmp2、PANX2、WNT7B、Cdkn1a等13个有潜力的AAⅠ肾毒性分子标志物。用降解能力最高的Sphingobium sp.AA3对AAⅠ含量较高的青木香进行发酵,并进行动物实验,再结合本研究中筛选得到的分子标志物对其毒性进行评价,获得了较为理想的效果。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

马兜铃酸降解菌和肾毒性分子标志物的筛选及应用察了各菌株在 King’s B 上产荧光色素的情况基中的磷酸盐可促进荧光素的产生，硫酸镁为离子，该培养基用于观察细菌产荧光色素的情下是可见色素。并对部分菌株用扫描电镜进行 1.2。

菌株的扫描电镜照片

湖北中医药大学 2019 届博士学位论文AAⅠ含量测定最佳波长的确定及标准曲线的绘制梯度浓度的马兜铃酸Ⅰ的基本无机盐培养基溶液λ=318nm 为最佳测定波长。继而以不含马兜铃酸溶液为空白对照，测定各浓度样品的 OD318值。以坐标，OD318值为纵坐标绘制标准曲线（图 1.2）， y=0.0036x-0.0017，相关系数为 R2=0.9991，说明中的马兜铃酸Ⅰ浓度与其 OD318值之间有着良好的
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本文编号：2855787