胡桃醌对恶性黑色素瘤生物学行为影响、胡桃醌-PLGA纳米粒制备及抑瘤作用评价

发布时间：2020-10-28 11:52

　　 第一部分胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞生物学行为的影响[实验目的]探究胡桃醌(Juglone,Jug)对恶性黑色素瘤细胞系的生物学行为的影响及相关机制的初步探究。[实验方法]采用噻唑蓝(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)法检测Jug对A375、A2058恶黑细胞的生长抑制率并计算IC50值。流式细胞仪检测Jug对恶黑细胞的周期及凋亡影响。蛋白免疫印迹法(Weastem blot,WB)检测Jug对恶黑细胞干预后凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及周期相关蛋白CyclinDl表达的影响。划痕实验和Transwell小室实验检测Jug对黑色素瘤细胞侵袭及迁移的影响。[实验结果与结论]Jug对A375、A2058恶黑存在明显抑制增殖作用,且存在明显的时间及浓度依赖,24h IC50值分别为:3.31μg/mL、2.81μg/mL;48h IC50值为:2.33μg/mL、2.16μg/mL。Jug可以通过增加促凋亡蛋白Bax表达及减少抗凋亡蛋白Bcl-2表达诱导A375、A2058恶黑细胞凋亡。Jug可以通过影响周期相关蛋白CyclinD1的表达将A375、A2058恶黑细胞周期阻滞于G0/G1期。Jug可以明显降低A375、A2058恶黑细胞侵袭及迁移能力。第二部分胡桃醌-PLGA纳米粒制备及抑瘤作用评价[实验目的]制备胡桃醌-聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米粒,考察其理化性质。评价其对恶性黑色素瘤细胞系A375及裸鼠皮下的抑瘤作用及相关安全性考察。[实验方法]采用乳化挥发法制备Jug-PLGA-NPs,对其粒径、包封率、载药率以及体外释放特征进行考察。荧光显微镜观察PLGA-NPs在体外细胞的摄取情况,小动物活体成像仪观测PLGA-NPs在BALB/c荷瘤裸鼠尾静脉注射后体内的分布。用MTT法比较Jug-PLGA-NPs与Jug对A375恶黑细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率。构建A375裸鼠皮下瘤模型,评价Jug及Jug-PLGA-NPs的抑瘤作用,处死后对内脏组织进行组织形态观察,对肿瘤组织行CyclinD1蛋白免疫组化检测并分析。[实验结果与结论]制备的Jug-PLGA-NPs平均粒径为149.6nm,包封率为68.39%,载药率5.07%,具有良好的缓释特征。PLGA-NPs在体外细胞摄取和体内活体成像中具有良好的穿透和靶向性能。不同浓度Jug-PLGA-NPs均能明显抑制A375细胞增殖、促进细胞凋亡,且呈明显时间浓度依赖(P0.05),且48h时略优于等浓度Jug。动物实验中Jug与Jug-PLGA-NPs均展现出良好的抑瘤效果,而纳米粒组抑瘤作用更好且小鼠耐受性更佳。结论:负载Jug的PLGA纳米微粒制备简便,具有良好的药物缓释、肿瘤靶向及体内外抗肿瘤能力,且生物安全性尚可,为未来Jug的临床应用提供了一种新的药物剂型。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R283.6;R285
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
引言
    一、恶性黑色素瘤的治疗药物现状
    二、中医药对恶性黑色素瘤的认识与治疗研究
    三、中药青龙衣及其主要成分胡桃醌抗肿瘤作用研究
第一部分 胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞生物学行为影响
    一、胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞增殖的影响
        1.1 实验材料
            1.1.1 细胞株
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 主要仪器及实验器材
        1.2 实验方法
            1.2.1 药物配置及分组
            1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖
            1.2.3 DAPI染色观察药物对细胞凋亡影响
            1.2.3 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡
            1.2.4 PI单染法检测细胞周期
            1.2.5 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达
        1.3 统计方法
        1.4 实验结果
            1.4.1 胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞增殖影响
            1.4.2 胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞凋亡影响
            1.4.3 胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞周期影响
    二、胡桃醌对恶性黑色素瘤细胞侵袭、迁移的影响
        2.1 实验材料
            2.1.1 细胞株
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器及实验器材
        2.2 实验方法
            2.2.1 0.1%结晶紫染液配制
            2.2.2 划痕实验检测胡桃醌对恶黑细胞迁移影响
            2.2.3 Transwell实验（不含基质胶）检测胡桃醌对恶黑细胞迁移影响
            2.2.4 Transwell实验（含基质胶）检测胡桃醌对恶黑细胞侵袭影响
        2.3 统计方法
        2.4 实验结果
            2.4.1 胡桃醌对恶黑细胞侵袭及迁移的影响
    三、讨论
    四、结论
第二部分 胡桃醌-PLGA纳米粒制备及抑瘤作用评价
    一、胡桃醌-PLGA纳米粒子制备
        1.1 实验材料
            1.1.1 细胞株及实验动物
            1.1.2 实验试剂
            1.1.3 主要仪器及实验器材
        1.2 实验方法
            1.2.1 纳米粒子制备
            1.2.2 纳米粒子的粒径分布及电镜形态
            1.2.3 胡桃醌浓度标准曲线绘制
            1.2.4 Jug-PLGA-NPs的包封率及载药量测定
            1.2.5 Jug-PLGA-NPs粒径稳定性检测
            1.2.6 Jug-PLGA-NPs的体外释放实验
        1.3 统计方法
        1.4 实验结果
            1.4.1 各处方制备Jug-PLGA-NPs外观
            1.4.2 各处方制备纳米粒子粒径、包封率及载药量
            1.4.3 纳米粒的表征
            1.4.4 纳米粒子的稳定性及体外释放
    二、胡桃醌-PLGA纳米粒体外对A375细胞增殖影响及体内外靶向性验证
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验细胞及动物
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器及实验器材
        2.2 实验方法
            2.2.1     MTT比色法检测细胞増殖影响
            2.2.2     Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡
            2.2.3 Jug-PLGA-NPs的体外细胞摄取
            2.2.4 荷瘤裸鼠活体成像
        2.3 统计方法
        2.4 实验结果
            2.4.1 胡桃醌裸药及纳米粒对A375恶黑细胞增殖影响比较
            2.4.2 胡桃醌裸药及纳米粒对A375恶黑细胞促凋亡作用比较
            2.4.3 PLGA纳米粒子的体外摄取及体内靶向情况
    三、胡桃醌-PLGA纳米粒对A375细胞体内抑瘤作用评价
        3.1 实验材料
            3.1.1 实验细胞及实验动物
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要仪器及实验器材
        3.2 实验方法及流程
            3.2.1 荷A375恶黑细胞皮下瘤动物模型造模
            3.2.2 实验分组及给药方式及剂量
            3.2.3 动物实验观测指标及处理流程
            3.2.4 肿瘤组织CyclinD1免疫组化
            3.2.5 实验动物内脏HE染色
        3.3 统计方法
        3.4 实验结果
            3.4.1 胡桃醌裸药及纳米粒体内抑瘤作用比较
            3.4.2 药物体内毒性分析
    四、讨论
    五、结论
参考文献
附录: （中英文缩略词对照）
攻读硕士期间取得的学术成果
致谢

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本文编号：2860054