清金化痰汤对AECOPD大鼠Beclin-1、LC3及炎症因子的影响

发布时间：2020-10-30 14:14

　　 目的:本课题采用分子生物学技术从气道上皮细胞自噬水平角度探讨清金化痰汤对AECOPD大鼠的影响,观察清金化痰汤干预后AECOPD大鼠气道上皮细胞后自噬相关Beclin-1、LC3蛋白及m RNA表达的变化与炎症情况,以明确其作用靶点。从而阐述AECOPD大鼠气道上皮细胞自噬与细胞因子、炎症介质的关系。从细胞分子层次为清金化痰汤对AECOPD防治的机制提供客观依据。方法:将健康雄性SPF级SD大鼠120只,体重180~220g,随机抽取其中60只制作含药血清,50只采用烟熏染毒+LPS(脂多糖)联合经典制备方法进行造模,10只作为空白对照。药物血清按照随机数字法分为6组(清金化痰汤高剂量组30 g/kg·d;清金化痰汤中剂量组15g/kg·d,清金化痰汤低剂量组7.5 g/kg·d,罗红霉素阳性对照组0.0175g/kg·d,模型组与空白对照组)每组20只。取造模成功后AECOPD大鼠50只与空白对照组10只阶段性进行气道上皮细胞原代培养。将制备的清金化痰汤含药血清按照DMEM-F12与药物血清10:1比例的培养液对原代培养的气道上皮细胞分组干预。HE染色观察肺组织变化,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测气道上皮Beclin-1、LC3m RNA的表达水平。运用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测气道上皮细胞Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白的表达水平,同时运用ELISA检测其IL-6,IL-8细胞炎症因子含量。结果:1.肺组织病理切片结果造模后大鼠肺组织病理切片HE染色显示大鼠支气管周围有炎性细胞浸润,气管壁增厚,管腔闭塞、狭窄,肺泡结构破坏明显,肺泡扩张并融合成肺大泡,肺泡腔内可见有渗出物。2.免疫荧光鉴定细胞绿色二抗标记的角蛋白表达阳性绿色荧光;DAPI染核呈现出的蓝色荧光;merge后可见上皮细胞阳性表达率达到99%以上。3.各组细胞血清干预后自噬因子Beclin-1、LC3 m RNA表达水平的变化与正常组比较,模型组大鼠气道上皮细胞血清干预后Beclin-1、LC3均有不同程度升高(P0.01);与模型对照组比较,用药组大鼠自噬相关因子Beclin-1、LC3表达下降约1倍(P0.01),其罗红霉素阳性对照组与清金化痰汤高剂量组下降明显,二者之间差异无统计学意义(P0.05)。4.各组大鼠气道上皮细胞血清干预后Beclin-1、LC3-I、LC3-II及LC3-II/I蛋白表达水平变化与正常组比较,模型组大鼠气道上皮细胞血清干预后Beclin-1、LC3-I、LC3-II及LC3-II/I均有不同程度升高(P0.01);与模型对照组比较,用药组自噬相关蛋白表达均有下降(P0.05),其中高剂量组蛋白表达水平明显降低(P0.01),趋于阳性对照组。5.各组大鼠气道上皮细胞血清干预后炎性因子IL-6、IL-8变化与正常对照组相比,模型组炎性因子IL-6、IL-8均有明显升高(P0.01);与模型组对照组比较,用药组气道上皮细胞炎症因子IL-6、IL-8有不同程度降低(P0.05),其中清金化痰汤高剂量组趋于阳性对照组,炎症因子明显低于模型对照组约1倍(二者之间差异无统计学意义P0.05)。结论:清金化痰汤可明显减轻AECOPD大鼠气道上皮细胞炎症反应,对气道上皮起到保护作用。其作用机制可能是通过对气道上皮细胞自噬的调节,抑制炎症因子IL-6、IL-8的水平,从而达到减轻炎症反应,发挥抗炎作用达到抑制COPD的急性发作与加重。
【学位单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

位置备皮清洁消毒之后，行正中小切口，用 10cm m 左右，逐层剥离，直到气管完全暴露。部位置的鼠板上抬使其和鼠板平面保持 45°，使用气管进行穿刺，通过气管注射 0.2 mL LPS 。完成立放置并且轻微摇晃大约 2 min ，让液体在双肺 3.0 缝合线缝合颈部皮肤，局部消毒，放置于干净流程均严格进行无菌操作。

（1）用 PBS 缓冲液冲洗 2 次，加入 0.25%胰蛋白酶-EDTA 溶液 2 mL，培养箱内消化约 4 分钟。（2）倒置显微镜下观察细胞变圆或者少量漂浮，如图 3-E,加细胞培养液（含 15%FBS、1%双抗）终止消化，使用一次性吸管多次吹打。（3）把细胞悬液移至 15 mL 离心管内，1000rpm/min 离心 2 分钟，弃掉上层清液，添加 1 mL细胞培养液并重悬细胞。（4）放入 30 mL 细胞培养瓶，并注入 2-3 mL 细胞培养液并放置于 37℃5% CO2 恒温孵育箱中培养 3 小时。（5）回收上清细胞悬液，即为上皮细胞，放入新的 30 mL 细胞培养瓶，并注入 2-3 mL 细胞培养液并放在 37℃ 5% CO2 孵育箱里培养。细胞贴壁后，每隔一天更换一次培养基，并且查看并记下细胞的生长状态。第2 代细胞的形态比较规则，呈鹅卵石状，大小比较均匀，见图 3-F。

图 3. COPD大鼠气道上皮细胞原代培养2.4.3 细胞计数通常情况下细胞要具有一定的密度才能够顺利增殖，因此对细胞进行计数。计数结果以每毫升细胞数表示。如果待测悬液里的细胞分布较为均匀，那么统计固定体积悬液里的细胞个数，便能够计算得到每毫升悬液里的细胞个数。（1）将计数板和盖片擦拭干净，同时把盖片盖于计数板上。（2）取出少量细胞悬液，滴于盖片边缘位置，使悬液将盖片与计数板中间填满，放置 3min，盖片的下方位置不能有气泡，也不可以使悬液流进旁边槽里。（3）算出板中4个格的细胞总量，压线细胞仅统计左边以及上方的个数。
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本文编号：2862592